Пептид у твердій фазі Синтез залишається основним способом отримання багатьох пептидів, що розробляються на замовлення. Однак ця галузь більше не обмежується однією моделлю виробництва. Синтез пептидів у рідкій фазі (LPPS), методи з використанням розчинних міток, гібридні процеси, потокова хімія, ферментативні етапи та лігація фрагментів тепер розширюють спектр доступних послідовностей та масштабів виробництва.
Вибір методу має важливе значення, оскільки синтез пептидів супроводжується низкою хімічних проблем. Під час кожного етапу сполучення необхідно утворити правильний амідний зв’язок, мінімізуючи при цьому рацемізацію, втрату аміногруп, перегрупування, окислення та реакції бічних ланцюгів. У міру подовження ланцюга також можуть змінюватися розчинність і схильність до агрегації.
Модифікації пептидів додають ще один рівень складності. Дослідник може замовити фосфорилювання для вивчення сигнальних шляхів, біотин для афінного вилучення, флуоресцентний барвник для візуалізації, жирну кислоту для дослідження взаємодії з мембраною або циклізацію для обмеження конформації. Кожен із цих варіантів змінює молекулярну масу, заряд, гідрофобність, особливості очищення та, часто, вимоги до зберігання.
У останніх оглядах синтез пептидів описується як сукупність взаємодоповнюючих технологій, а не як конкуренція, в якій є один універсальний переможець. До них належать класичний синтез у розчині, SPPS, LPPS, лігація, потокові методи, фотокаталітичні підходи, електрохімія та гібридні стратегії виробництва.
У цій статті пояснюється, чим LPPS відрізняється від SPPS, як хіміки розробляють модифіковані пептиди, як лабораторії оцінюють складні послідовності та які аналітичні контролі забезпечують надійність дослідницьких матеріалів.
При синтезі пептидів у рідкій фазі проміжні сполуки пептидів утворюються в умовах, коли вони залишаються розчинними або диспергуються в рідкій реакційній системі.
При класичному синтезі в розчинній фазі проміжний продукт зазвичай виділяють та очищують після одного або декількох етапів сполучення. Натомість у сучасному LPPS можуть застосовувати розчинну молекулярну мітку, групу, що змінює фазу, стратегію осадження, мембранне розділення, екстракцію або інший метод, який спрощує вилучення проміжного продукту.
Метод LPPS із використанням міток спрямований на поєднання корисних особливостей хімії розчинів та синтезу з використанням носіїв. Гідрофобна або іншим чином модифікована мітка може змінювати розчинність ланцюга, що утворюється, що дозволяє відокремлювати реагенти та побічні продукти шляхом екстракції або осадження.
Наприклад, у методі AJIPHASE застосовується підхід із використанням анкерів та багаторазове подовження у розчинній фазі. У опублікованій стратегії «в одній посудині» проміжні сполуки виділяли шляхом екстракції розчинником замість традиційного хроматографічного очищення після кожного етапу.
LPPS — це метод хімічного синтезу. Це не пептид, і він не має молекулярної формули чи молекулярної маси.
Продукція компанії LPPS — це пептиди з визначеною послідовністю, пептидні фрагменти або захищені проміжні пептидні сполуки. Їхні молекулярні властивості залежать від послідовності, хімічного складу кінцевих груп, захисних груп, міток та кінцевих модифікацій.
Важливе наукове розрізнення: Синтез пептидів у рідкій фазі не слід плутати з розділенням «рідина–рідина», розчиненням пептидів, водними препаратами або біологічним рибосомальним синтезом. Термін LPPS стосується саме хімічного синтезу пептидних ланцюгів із використанням розчинних або фазорегульованих проміжних сполук.
Основною складовою залишається ланцюг амінокислот, з’єднаний пептидними зв’язками:
–NH–CHR–CO–NH–CHR–CO–
Однак під час синтезу реактивні групи потребують контрольованого захисту.
Fmoc захищає альфа-аміногрупу під час сполучення і згодом може бути видалений у лужних умовах. Boc пропонує альтернативну стратегію, що базується на кислотній лабільності.
Реактивні бічні ланцюги також потребують захисту. Приклади:
Схема захисних груп повинна залишатися ортогональною. Іншими словами, одна реакція повинна видаляти потрібну групу, не руйнуючи при цьому інші.
Метод LPPS із використанням мітки передбачає приєднання пептиду, що синтезується, до розчинного допоміжного компонента. Цей компонент може покращити розчинність у органічній фазі або полегшити селективне виділення. Після завершення синтезу ланцюга хімік видаляє мітку, щоб вивільнити цільовий пептид.
Постійні модифікації пептидів відрізняються від тимчасових захисних груп тим, що модифікація залишається в кінцевому продукті. У технічному огляді компанії Bachem також проводиться розмежування між постійними хімічними змінами та групами, що використовуються виключно для контролю синтезу.
У технології SPPS ланцюг, що утворюється, приєднується до нерозчинної смоли. Хіміки додають реагенти в надлишку, а потім видаляють розчинну речовину шляхом фільтрування та промивання.
До переваг належать:
Серед викликів можна виділити:
У 2024 році в результаті галузевого аналізу 40 технологічних процесів з виробництва пептидів було зафіксовано середню масову інтенсивність процесу приблизно на рівні 13 000 для SPPS, що свідчить про значне споживання матеріалів у сучасному виробництві пептидів.
У методі LPPS проміжні сполуки зберігаються у розчині або використовується розчинний носій.
До потенційних переваг належать:
Серед можливих проблем можна назвати:
Багато сучасних методів поєднують особливості обох платформ. У рамках одного проєкту можуть використовуватися SPPS для підготовки фрагментів, LPPS для окремих етапів елонгації та нативна хімічна лігація для з’єднання очищених сегментів.
Отже, вибір методу повинен залежати від послідовності та запланованого масштабу, а не від універсального твердження про те, що одна платформа завжди працює краще.
Протеїнкінази додають фосфатні групи до залишків серину, треоніну або тирозину в біологічних системах. Синтетичні фосфопептиди дають можливість лабораторіям досліджувати розпізнавання кіназами, активність фосфатаз, специфічність антитіл, зв’язування з сигнальними доменами та взаємодії, що залежать від модифікацій.
Фосфорилювання додає негативний заряд і може впливати на ступінь утримання під час ВЕРХ із зворотньою фазою. Багатофосфорильовані послідовності можуть ускладнювати синтез та хроматографічне розділення через підвищену кислотність та зміну характеристик активації або очищення.
N-кінцеве ацетилювання нейтралізує кінцеву аміногрупу, тоді як C-кінцеве амідирування усуває негативний заряд, пов’язаний із вільною кінцевою карбоксильною групою.
Ці модифікації можуть краще відтворювати нативну послідовність, підвищувати стійкість до деяких екзопептидаз або змінювати взаємодію з рецепторами. Однак їх не слід додавати автоматично, оскільки кінцевий заряд може бути частиною запланованого експериментального механізму.
Біотин може використовуватися для іммобілізації, афінного захоплення, аналізів типу «pull-down» та виявлення за допомогою систем на основі авідіну або стрептавідину.
Вкладення Важливе значення мають місце розташування та довжина лінкера. Пряме біотінілювання N-кінця може блокувати мотив розпізнавання, тоді як надто довгий або гідрофобний лінкер може змінити поведінку білка. Відповідний немаркований пептид допомагає виявити ефекти, пов’язані з маркуванням.
Флуорофори дають змогу проводити мікроскопію, визначати місцезнаходження, вимірювати поглинання, зв’язування та розщеплення ферментами.
Проте флуорофор може становити значну частину кінцевої молекулярної маси та гідрофобної поверхні. Він також може впливати на заряд, агрегацію, неспецифічне зв’язування з мембраною та ретенцію в ВЕРХ.
Жирні кислоти або інші групи ліпідів можуть посилювати зв’язування з мембраною, гідрофобність, взаємодію з альбуміном або самоорганізацію.
Ліпідізовані пептиди можуть вимагати застосування модифікованих методів очищення та забезпечення розчинності. Утворення міцел може впливати на видиму концентрацію та біологічні показники.
У результаті циклізації можна з'єднати N- та C-кінці, дві бічні ланцюги або бічний ланцюг і кінець. Зв'язки можуть бути амідними, дисульфідними, тіоефірними, ефірними, вуглець-вуглецевими або утвореними методом «клік».
Циклічні структури можуть знижувати конформаційну гнучкість, а іноді й підвищувати стійкість до ферментативного розщеплення. Проте циклізація не гарантує наявності єдиної активної конформації, вищого афінності або простоти синтезу. Важливе значення мають розмір кільця, послідовність, концентрація реакції та конкуруюча олігомеризація.
Важкі ізотопи вуглецю, азоту, водню або кисню можуть слугувати внутрішніми еталонами для кількісної мас-спектрометрії.
Позначені позиції залишків повинні відповідати вимогам аналітичного методу та запобігати втраті або обміну ізотопів. Лабораторії також повинні розрізняти ізотопне збагачення, хімічну чистоту та вміст пептидів.
Модифіковані пептиди дають дослідникам змогу виділити одну молекулярну змінну.
Наприклад, у дослідженні можна порівняти:
Така комбінована схема може сприяти більш ґрунтовній механістичній інтерпретації. Проте, по можливості слід змінювати лише одну змінну. Якщо змінюються і послідовність, і мітка, результат може не дозволити визначити, яка саме зміна спричинила ефект.
Метод SPPS дозволяє синтезувати пептид, додаючи по одному захищеному залишку за раз. Він залишається особливо корисним для виробництва в дослідницьких масштабах, отримання модифікованих пептидів та паралельного синтезу.
Метод синтезу в розчині дозволяє отримувати та виділяти пептидні фрагменти або короткі пептиди за допомогою загальноприйнятих методів органічної хімії. Він може бути доцільним для коротких послідовностей, конвергентного складання фрагментів або масштабних процесів, у яких добре працюють методи кристалізації чи екстракції.
Розчинний маркер регулює фазову поведінку та дозволяє здійснювати багаторазове з'єднання, зняття захисної групи та виділення. Цей підхід спрямований на зменшення обсягу робіт з очищення, що традиційно пов'язані з синтезом у розчині.
NCL з'єднує пептидний тіоестер з пептидом, що містить N-кінцевий цистеїн, у результаті чого утворюється нативна амідна зв'язок.
Ця технологія дозволяє синтезувати довші поліпептиди та білки з модифікаціями в конкретних місцях на основі синтетичних фрагментів. Розширення, що передбачають десульфурацію та використання альтернативних тіолвмісних залишків, розширили перелік можливих місць лігації.
За певних умов ферменти можуть утворювати або модифікувати пептидні зв’язки. Хіміко-ферментативні технологічні процеси поєднують хімічний контроль із ферментативною селективністю, хоча на їхню реалізацію впливають спектр субстратів, доступність ферментів та розробка технологічного процесу.
Розглянемо гіпотетичний пептид із 42 залишками, який має:
При використанні прямого однокомпонентного методу SPPS можуть виникати такі проблеми, як агрегація, неповне з'єднання, окислення та складнощі з очищенням.
У рамках структурованого аналізу техніко-економічної доцільності можна порівняти три варіанти:
Переваги:
Ризики:
Переваги:
Ризики:
Переваги:
Ризики:
Оптимальний підхід залежить від масштабу експерименту, наявного обладнання, сумісності компонентів та прийнятного терміну розробки. Постачальник не повинен обіцяти успіх, спираючись виключно на кількість залишків.
У наведеній нижче таблиці узагальнено загальні характеристики, зафіксовані в сучасних оглядах літератури з синтезу пептидів.
| Параметр | SPPS | LPPS | З'єднання фрагментів |
|---|---|---|---|
| Проміжний стан | Зв’язаний з нерозчинною смолою | Розчинні або з використанням міток | Очищені пептидні фрагменти |
| Основна операція | З'єднання, промивання та фільтрація | З'єднання з екстракцією або осадженням | Хемоселективне з'єднання фрагментів |
| Автоматизація | З добре налагодженою репутацією | Залежить від процесу | Менш стандартизований |
| Проміжний аналіз | Потрібно взяти зразок смоли або розрізати її | Часто простіше знайти рішення | Кожен фрагмент можна проаналізувати |
| Надлишок реагенту | Часто відносно високий | У оптимізованих системах це значення може бути зменшене | Залежить від хімічних особливостей лігації |
| Загальна сила | Дослідження пептидів та їх модифікацій | Процеси масштабування та використання розчинних міток | Довші поліпептиди та білки |
| Головне завдання | Використання розчинників та агрегація на основі смоли | Проміжна ізоляція та розчинність | Проектування з'єднань та обробка фрагментів |
| Основна відмінність | Нерозчинний носій | Складання ланцюгів у рідкій фазі | З'єднує попередньо сформовані пептидні сегменти |
Модифікація впливає на стабільність та керованість. Тому в лабораторії слід уникати копіювання інструкцій щодо зберігання з послідовності, що не має до цього відношення.
Цистеїн, метіонін і триптофан можуть піддаватися окисненню. На цей процес можуть впливати вплив кисню, світло, забруднення металами та умови розчину.
Фосфопептиди можуть відрізнятися за розчинністю та хроматографічними властивостями від своїх немодифікованих аналогів. У разі застосування сильнокислих умов або тривалої обробки також може знадобитися оцінка, що враховує специфіку конкретного проекту.
Захищайте флуоресцентні мітки від зайвого світла. Крім того, перевірте, чи не змінює барвник свою видиму розчинність або чи не сприяє адсорбції на пластикових поверхнях.
Гідрофобні кон'югати можуть утворювати агрегати або міцели. Зазначена концентрація у розчині може не відповідати концентрації вільно диспергованого мономеру.
Для утворення дисульфідних зв’язків необхідний контроль над окисленням та утворенням пар. Пептид із чотирма залишками цистеїну теоретично може утворювати різні схеми спарювання, тому за масою неможливо розрізнити всі ізомери дисульфідних зв’язків.
Ліофілізація часто підвищує стабільність при зберіганні завдяки зменшенню молекулярної рухливості та гідролітичних реакцій. Проте на стабільність все ще впливають залишкова волога, склад препарату, температура та твердотільна структура пептиду.
Перевірте послідовність, групи на кінцях ланцюга, позицію модифікації, протиіон, ступінь окиснення та місце мічення.
Не варто покладатися на скорочену назву товару.
Порівняйте очікувану та виміряну масу, хроматографічну чистоту, ознаки модифікації та будь-які результати аналізу вмісту.
Не слід вважати, що наявність одного вираженого піку в результатах ВЕРХ однозначно свідчить про правильність модифікації.
Перед відкриттям дайте контейнеру нагрітися до кімнатної температури.
Уникайте утворення конденсату на холодних матеріалах.
Враховуйте заряд, гідрофобність, хімічні властивості барвників, вміст ліпідів та сумісність з методами аналізу.
Не слід намагатися розчиняти у воді кожен модифікований пептид.
Почніть з контрольованого об’єму, огляньте зразок і поступово розбавляйте.
Уникайте надмірного перемішування у вихровому режимі матеріалів, схильних до агрегації або таких, що легко окислюються.
Підготуйте об’єми, що відповідають умовам експерименту.
Уникайте багаторазового заморожування та розморожування всього запасу.
У разі необхідності обмежте надмірне освітлення, доступ кисню, нагрівання або екстремальні значення рН.
Уникайте зберігання пробірок без етикеток, на яких не вказано деталі модифікації.
МС або ЛК-МС повинні підтвердити, що виявлена маса відповідає структурі цільової сполуки. У разі великих флуорофорів, ліпідних груп або ізотопних міток розрахунок повинен враховувати повний кон’югат.
Метод RP-HPLC дозволяє оцінити частку основного виявленого компонента за заданою методикою. У разі спільного елюювання домішок можуть бути корисними ортогональні градієнти або стаціонарні фази.
Правильне значення загальної маси не завжди дозволяє визначити місце модифікації. Можуть знадобитися тандемна масс-спектрометрія, ферментативний розщеплення, ЯМР, аналіз амінокислот або інші методи визначення структури.
Пептид може мати очікувану загальну масу, але неправильні дисульфідні зв’язки. Для визначення структури може знадобитися селективне відновлення, ферментативний розщеплення, LC-MS/MS або порівняння з валідованими еталонами.
Ліофілізований матеріал може містити пептид, протиіони, воду, залишки розчинника та компоненти буферного розчину. Тому зважування порошку не завжди дозволяє визначити молярну кількість пептиду.
При порівнянні партій слід застосовувати однакові аналітичні методи. Зміна колонки ВЕРХ, градієнта, довжини хвилі детекції, правила інтегрування або концентрації зразка може призвести до того, що дві партії, які за інших умов були б подібними, будуть виглядати різними.
LPPS — це хімічний метод, за допомогою якого відбувається синтез пептидних ланцюгів, при цьому проміжний продукт, що утворюється, залишається розчинним або контролюється за допомогою розчинного маркера чи допоміжної речовини, стан якої можна регулювати. Сучасні системи можуть використовувати екстракцію, осадження або мембранне виділення для видалення надлишку реагентів та побічних продуктів між циклами.
Ні. LPPS — це платформа для синтезу. Продуктом є пептид, фрагмент пептиду або захищений проміжний продукт. Як технологічний процес, LPPS не має єдиної формули, молекулярної маси, біологічної активності чи температури зберігання.
Метод SPPS фіксує пептид, що синтезується, на нерозчинній смолі та видаляє розчинну фракцію шляхом промивання. Метод LPPS утримує ланцюг, що синтезується, у системі рідкої фази та базується на екстракції, осадженні, хроматографії, мембранному розділенні або фазовій поведінці за допомогою міток. Кожен із цих методів має свої переваги щодо автоматизації, аналізу, використання реагентів, масштабу та складних послідовностей.
Ні. Ефективність залежить від послідовності, масштабу, хімічних властивостей міток, методу виділення, системи розчинників, модифікації та кінцевого рівня чистоти. Для багатьох дослідних пептидів метод SPPS може залишатися швидшим і простішим, тоді як метод LPPS може мати переваги в окремих випадках масштабування або моніторингу розчину.
Модифікації пептидів — це постійні структурні зміни, що входять до складу кінцевого продукту. До прикладів належать фосфорилювання, ацетилювання, амідирування, метилювання, біотинілювання, флуоресцентне маркування, ліпідізація, глікозилювання, циклізація та введення стабільних ізотопів. Вони відрізняються від тимчасових захисних груп, які видаляються під час синтезу.
Часто так, але реалістичність зменшується із зростанням структурної складності. Кожна додаткова група може впливати на зв’язування, депротекцію, розчинність, очищення, аналітичне виявлення та стабільність. Проект із багаторазовою модифікацією повинен пройти технічну експертизу до затвердження остаточної специфікації.
Модифікація може призвести до утворення тісно пов’язаних побічних продуктів, зміни гідрофобності, підвищення кислотності, агрегації або утворення позиційних та окислювальних ізомерів. Послідовності, що підлягають видаленню, також можуть мати час утримання, близький до цільового. Відповідний метод очищення повинен забезпечувати виділення саме цільової структури, а не просто утворення одного домінуючого піку.
МС дозволяє підтвердити зміну маси, що відповідає фосфорилюванню. Однак, коли група може бути приєднана до кількох залишків, сама лише маса інтактної молекули може не дозволити визначити точне місце розташування. Може знадобитися тандемна МС, аналіз фрагментів, ферментативні дослідження або інший метод, що дозволяє визначити конкретне місце.
Ні. Циклізація може обмежувати конформацію та знижувати чутливість до деяких протеаз, але цей ефект залежить від розміру кільця, хімічної структури зв’язку, амінокислотної послідовності та умов проведення аналізу. Неправильно спарені дисульфідні зв’язки або неправильно сконструйовані кільця можуть знижувати активність або призводити до утворення гетерогенних продуктів.
Умови зберігання повинні відповідати вимогам щодо стабільності як пептиду, так і флуорофора. Загалом лабораторіям слід мінімізувати непотрібне опромінення світлом, обмежувати кількість циклів заморожування–розморожування, використовувати сумісні ємності та контролювати процес агрегації або адсорбції. Конкретна температура та розчинник залежать від послідовності та барвника.
Базовий пакет зазвичай включає аналітичну ВЕРХ та МС або ВЕРХ-МС. Більш складні проекти можуть вимагати використання тандемної МС, аналізу амінокислот, ЯМР, картування дисульфідних зв’язків, оптичної спектроскопії, аналізу вмісту пептидів, аналізу води, визначення залишків розчинника або функціонального аналізу.
Лігація фрагментів стає доцільною, коли прямий поетапний синтез дає сиру продукцію низької якості, призводить до значної агрегації або унеможливлює очищення, особливо у випадку довгих або сильно модифікованих мішеней. Послідовність повинна забезпечувати відповідну стратегію лігації, а кожен фрагмент має залишатися доступним у достатній чистоті та кількості.
SPPS, синтез пептидів у рідкій фазі (LPPS) та лігація фрагментів є взаємодоповнюючими стратегіями. SPPS забезпечує відпрацьовану автоматизацію та широку гнучкість у дослідницьких масштабах. LPPS дає змогу здійснювати моніторинг у фазі розчину та забезпечує потенційні переваги щодо масштабування або використання реагентів у відповідних процесах. Лігація фрагментів розширює хімічні можливості для отримання довших і складніших поліпептидів.
Модифікації пептидів дають змогу розробляти високоспецифічні дослідницькі схеми, але вони також впливають на молекулярну масу, заряд, розчинність, умови очищення, стабільність та аналітичні вимоги. Тому дослідники повинні чітко визначати мету кожної модифікації та, за можливості, включати відповідні контрольні зразки.
Повна оцінка якості повинна охоплювати ідентифікацію, чистоту, вміст, докази наявності місць модифікації та відповідність послідовності. Жодна окрема хроматограма ВЕРХ або масс-спектральний сигнал не може дати відповіді на всі питання щодо якості.
Тільки для наукових досліджень. Не призначено для застосування у людей.
