Peptidaufreinigungsdienstleistungen für Forschungsprojekte
Dienstleistungen zur Peptidaufreinigung die Zielsequenz von Deletionsprodukten, verkürzten Sequenzen, Resten der Schutzgruppen, Oxidationsprodukten und anderen prozessbedingten Bestandteilen zu trennen.
Die Reinigungsleistung hängt jedoch vom jeweiligen Peptid ab.
Sequenzlänge, Hydrophobie, Ladung, Aggregationsneigung, Art der Modifikation, Rohqualität und angestrebte Reinheit beeinflussen die Methodenentwicklung.
Daher prüft ALLGROWPEPTIDE jedes Aufreinigungsprojekt, bevor der Prozess, die erreichbare Reinheit, die gewonnene Menge, die Prüfungen und der Lieferzeitplan bestätigt werden.
Projektspezifische Peptidaufreinigung
Eine Standardmethode mag zwar für viele Peptide geeignet sein, löst jedoch nicht jedes Trennungsproblem.
So kann sich beispielsweise eine Deletionssequenz vom Zielpeptid nur durch eine einzige Aminosäure unterscheiden. Ebenso kann eine oxidierte Form ein sehr ähnliches chromatographisches Verhalten aufweisen.
Daher sollte die Bereinigung eher mit einer technischen Überprüfung beginnen als mit einem festen Versprechen.
Die Überprüfung sollte folgende Punkte umfassen:
- Zielsequenz;
- rohe Reinheit;
- Rohmenge;
- erwartete Molekülmasse;
- Anschlussstruktur;
- Änderungen;
- Löslichkeit;
- Zielreinheit;
- erforderliche Rückgewinnungsmenge;
- Anforderung an das Gegenion;
- analytische Untersuchungen.
So funktioniert die Peptidaufreinigung mittels RP-HPLC
Die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist nach wie vor ein weit verbreitetes Verfahren zur Peptidaufreinigung.
Bei einem typischen Verfahren interagiert die stationäre Phase mit den Peptiden in Abhängigkeit von deren Hydrophobie. Gleichzeitig ändert sich der Gradient der mobilen Phase im Laufe der Zeit, sodass verschiedene Komponenten die Säule an unterschiedlichen Stellen verlassen können.
Anschließend werden die Fraktionen gesammelt und analysiert. Danach können geeignete Fraktionen zusammengestellt, konzentriert und für die Endverarbeitung vorbereitet werden.
Faktoren, die die Peptidaufreinigung beeinflussen
| Peptidfaktor | Mögliche Auswirkungen auf die Reinigung |
|---|---|
| Hydrophobie | Kann zu einer erhöhten Retention, Aggregation oder einer schlechten Rückgewinnung führen |
| Sequenzlänge | Kann zu einer Erhöhung der Anzahl eng verwandter Syntheseverunreinigungen führen |
| Deletion eines einzelnen Aminosäurerests | Kann eine Verunreinigung mit ähnlichem chromatographischem Verhalten verursachen |
| Oxidationsempfindliche Rückstände | Kann zusätzliche molekulare Formen erzeugen |
| Cyclisierung | Es können lineare, teilweise zyklische oder falsch verbundene Komponenten entstehen |
| Fluoreszenz- oder Lipidmarker | Kann die Hydrophobie und die Detektionsreaktion erheblich verändern |
| Aggregation | Kann die Leistung der Säule und die Ausbeute beeinträchtigen |
| Hohe Zielreinheit | Erfordert möglicherweise zusätzliche Zyklen und verringert die endgültige Rückgewinnung |
Arbeitsablauf zur Peptidaufreinigung
1. Das Rohmaterial prüfen
Überprüfen Sie zunächst die Sequenz, die ungefähre Menge, das vorliegende Chromatogramm, die erwartete Masse und die Zielspezifikation.
2. Löslichkeit bestimmen
Bestimmen Sie als Nächstes eine geeignete Belastungsbedingung, die die Auflösung fördert, ohne das Peptid zu beschädigen.
3. Entwicklung der Trennmethode
Das Reinigungsteam wählt anschließend die stationäre Phase, den Gradienten, die Detektionswellenlänge, die Durchflussbedingungen und die Fraktionsstrategie aus.
4. Führen Sie eine präparative Trennung durch
Das Rohpeptid wird in einzelne Fraktionen aufgeteilt.
5. Analysiere die Brüche
Mithilfe von HPLC und Massenspektrometrie lassen sich Fraktionen identifizieren, die das Zielpeptid enthalten.
6. Geeignete Fraktionen zusammenfassen
Die ausgewählten Fraktionen werden gemäß den genehmigten Reinheits- und Identitätskriterien zusammengestellt.
7. Abschließende Bearbeitung abschließen
Abschließend wird das gereinigte Material konzentriert, in das festgelegte Format überführt, gegebenenfalls gefriergetrocknet und verpackt.
Tabelle zum Reinigungsprozess
| Bühne | Hauptaktivität | Ergebnis |
|---|---|---|
| Rückblick auf den Rohölmarkt | Sequenz, Rohprofil und Projektziel bewerten | Reinigungsplan |
| Methodenentwicklung | Spalten- und Farbverlaufsbedingungen auswählen | Verbesserte Zielunterscheidung |
| Präparativer Durchlauf | Rohmaterial trennen und Fraktionen sammeln | Einzelne Fraktionen |
| Bruchanalyse | HPLC- und Massenspektrometrie-Ergebnisse überprüfen | Fraktionen, die das Zielmolekül enthalten |
| Bündelung | Brüche zusammenfassen, die die Projektkriterien erfüllen | Gereinigte Peptidlösung |
| Abschließende Bearbeitung | Konzentrieren, gefriertrocknen und verpacken | Fertiggestelltes Forschungsmaterial |
Auswahl der Zielreinheit
Eine höhere Zielreinheit erfordert in der Regel eine stärkere Trennung zwischen dem Zielstoff und eng verwandten Verunreinigungen.
Daher kann eine längere Reinigungszeit erforderlich sein. Zudem kann eine wiederholte Aufbereitung die endgültige Ausbeute verringern.
Daher sollten Kunden folgende Aspekte gegeneinander abwägen:
- beabsichtigte Forschungszwecke;
- Verunreinigungsempfindlichkeit;
- erforderliche Menge;
- erreichbare Trennung;
- Budget;
- Zeitplan.
Die separate Leitfaden zur Auswahl der Peptidreinheit sollte hier intern verlinkt werden.
Schwierige Peptidaufreinigung
Stark hydrophobe Peptide
Diese Peptide können eine geringe Wasserlöslichkeit, eine starke Retention an der Säule oder Aggregation aufweisen.
Eng verwandte Deletionssequenzen
Ein Unterschied von nur einem Aminosäurerest kann lediglich zu einer geringfügigen Veränderung des chromatographischen Verhaltens führen. Daher sind für dieses Verfahren möglicherweise ein flacher Gradient oder alternative Bedingungen erforderlich.
Oxidierte Peptide
Cys, Met und Trp können oxidationsbedingte Formen bilden. Daher sollten die Handhabungsbedingungen eine unnötige Exposition begrenzen.
Zyklische oder disulfidreiche Peptide
Diese Projekte können lineare, teilweise gefaltete oder falsch verbundene Komponenten enthalten.
Modifizierte Peptide
Fluoreszenzfarbstoffe, Lipide, Linker und Affinitätsmarker können sowohl die Retention als auch die Detektorantwort beeinflussen.
Analytische Freigabetests
| Testen oder Aufzeichnen | Zweck |
|---|---|
| Analytische HPLC | Bewertung der endgültigen chromatographischen Reinheit |
| Massenspektrometrie | Unterstützt die Identifizierung der Zielmoleküle |
| Aussehen | Erfasst das endgültige äußere Erscheinungsbild |
| Anzahl | Bestätigt die gelieferte Menge |
| Chargennummer | Verknüpft das Material mit den Prüf- und Verpackungsprotokollen |
| Weitere Analyse | Kann Gehalt, Wasser, Gegenion oder eine andere vereinbarte Untersuchung umfassen |
Häufig gestellte Fragen
Können Sie Peptidmaterial reinigen, das von einem anderen Lieferanten hergestellt wurde?
Rohmaterial von Drittanbietern kann geprüft werden, nachdem Reihenfolge, Menge, Rohmaterialprofil, Dokumentation und Versandbedingungen überprüft wurden.
Garantiert die Reinigung eine bestimmte Ausbeute?
Nein. Die Ausbeute hängt von der Rohölqualität, der Reihenfolge der Schritte, der Löslichkeit, dem Verunreinigungsprofil und der angestrebten Reinheit ab.
Kann jedes Peptid eine HPLC-Reinheit von ≥98% erreichen?
Nein. Eng verwandte Verunreinigungen und schwierige Sequenzeigenschaften können die erreichbare Trennung einschränken.
Welche Methode wird üblicherweise verwendet?
Die präparative RP-HPLC wird häufig zur Peptidaufreinigung eingesetzt, wobei die endgültige Methode jedoch vom jeweiligen Projekt abhängt.
Welche Unterlagen werden bereitgestellt?
Zu den verfügbaren Unterlagen können ein COA, ein HPLC-Chromatogramm, ein Massenanalysebericht, eine Sequenz, die Menge sowie Chargeninformationen gehören.
Verbessern Sie die Reinheit Ihres Peptidprojekts
Geben Sie die Sequenz, die Rohmenge, die aktuelle Reinheit, das Chromatogramm, die Massenangaben, die angestrebte Reinheit und die erforderliche Ausbeute an.
Unser technisches Team wird das Material prüfen, bevor die Aufbereitungsstrategie festgelegt wird.