HPLC und Massenspektrometrie zur Qualitätsprüfung von Peptiden
Die HPLC wird üblicherweise zur Trennung peptidbezogener Komponenten und zur Abschätzung der chromatographischen Reinheit eingesetzt, während die Massenspektrometrie zur Bestätigung der molekularen Identität durch Auswertung der Masse-zu-Ladungs-Verhältnisse dient. Daher sollte keine der beiden Methoden für sich genommen als vollständige Qualitätsbewertung betrachtet werden. Stattdessen sollten die Ergebnisse unter Berücksichtigung der Peptidsequenz, der Salzform, der Spezifikation und der Prüfmethode interpretiert werden.
Was zeigt die HPLC?
Bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie werden die Probenbestandteile entsprechend ihrer Wechselwirkungen mit einer stationären Phase und einer mobilen Phase getrennt. Folglich können das Zielpeptid und die damit verbundenen Verunreinigungen als separate chromatographische Peaks erscheinen, wenn die Methode eine ausreichende Trennung gewährleistet.
Allgemeines Kapitel der USP <621> bezieht die HPLC in die für die qualitative und quantitative Analyse verwendeten chromatographischen Verfahren ein und behandelt zudem Konzepte zur Systemtauglichkeit.
Ein HPLC-Flächenanteil steht jedoch nicht automatisch für:
- absoluter Peptidgehalt;
- Füllgenauigkeit der Fläschchen;
- Sterilität;
- Endotoxingehalt;
- molekulare Identität;
- Restwasser;
- Gegionengehalt.
Was zeigt die Massenspektrometrie?
Die Massenspektrometrie liefert molekulare Informationen, indem sie Ionen anhand ihres Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses misst. Daher kann eine gemessene Masse mit der erwarteten Masse verglichen werden, die sich aus der Peptidsequenz und den Modifikationen ergibt.
Dennoch kann die angegebene Masse durch folgende Faktoren beeinflusst werden:
- Ladungszustand;
- Adduktbildung;
- Gegenionen;
- Isotopenverteilung;
- Oxidation oder Abbau;
- Terminal-Modifikationen;
- konjugierte Marker;
- Geräte- und Verarbeitungseinstellungen.
Vergleich von HPLC und MS
| Analytikbereich | HPLC | Massenspektrometrie |
|---|---|---|
| Hauptaufgabe | Trennung der Bestandteile und Bestimmung der Reinheit | Unterstützung bei der Bestimmung der Molekülmasse und der Identifizierung |
| Typische Ausgabe | Chromatogramm und Daten zur Peakfläche | Massenspektrum und Daten zu den beobachteten Ionen |
| Nützlich für | Reinheit, Verunreinigungsprofil und Konsistenz | Voraussichtliche Masse und Bestätigung der Struktur |
| Hauptbeschränkung | Beweist für sich genommen noch keine Identität | Beweist allein noch nicht die chromatographische Reinheit |
| Bewährte Verfahren | Die Ergebnisse werden unter Berücksichtigung der Spezifikation und der Methode ausgewertet. | |
Was sollte in einem HPLC-Bericht überprüft werden?
| Berichtselement | Warum das wichtig ist |
|---|---|
| Probenidentifizierung | Verknüpft den Bericht mit der geprüften Charge |
| Rubrik und Methode | Liefert analytischen Kontext |
| Detektionswellenlänge | Beeinflusst den Frequenzgang des aufgezeichneten Signals |
| Verweilzeit | Unterstützt Spitzenwertvergleich |
| Prozentualer Anteil der Peakfläche | Unterstützt die Berechnung der chromatographischen Reinheit |
| Integration | Zeigt, wie die Spitzengrenzen zugewiesen wurden |
| Systemtauglichkeit | Unterstützt die Leistungsfähigkeit der Methode während der Analyse |
Validierung von Analysemethoden
Ein Analysemethoden sollte entsprechend seinem Verwendungszweck konzipiert und validiert werden. Daher muss der Validierungsplan das jeweils zu messende Qualitätsmerkmal widerspiegeln, wie beispielsweise Identität, Gehalt, Reinheit, Verunreinigungen oder ein anderes relevantes Merkmal.
ICH Q2(R2) beschreibt wichtige Leistungsmerkmale, darunter Spezifität bzw. Selektivität, Genauigkeit, Präzision und den Berichtsbereich. Darüber hinaus dient die Systemeignung der routinemäßigen Überprüfung der analytischen Leistung, während die Robustheit in der Regel während der Methodenentwicklung bewertet wird, um sicherzustellen, dass geringfügige Abweichungen im Verfahren die Ergebnisse nicht wesentlich beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
Bedeutet ein HPLC-Ergebnis von 98%, dass das Fläschchen 98%-Peptid nach Gewicht enthält?
Nicht unbedingt. Der HPLC-Flächenanteil und der Netto-Peptidgehalt sind unterschiedliche Messgrößen.
Kann die Peptidsequenz mittels Massenspektrometrie vollständig bestätigt werden?
Die MS kann die molekulare Identifizierung zuverlässig untermauern; je nach Molekül und Projekt kann für eine vollständige Sequenzbestätigung jedoch der Einsatz weiterer Methoden erforderlich sein.
Warum geben verschiedene Labore leicht unterschiedliche HPLC-Reinheitsgrade an?
Unterschiedliche Säulen, Gradienten, Wellenlängen, Integrationsparameter, Geräte und Probenvorbereitungen können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen.
Sollten Chromatogramme mit einer Chargennummer verknüpft werden?
Ja. Der Bericht sollte auf die tatsächlich geprüfte Charge zurückverfolgbar sein.
Verfügbare Analysedaten anfordern
Erkundigen Sie sich, ob für das von Ihnen ausgewählte Produkt HPLC-Chromatogramme, Massenspektrometriedaten, Prüfverfahren oder chargenspezifische Analyseprotokolle vorliegen.