Синтез пептидів на замовлення це дає дослідникам можливість безпосередньо контролювати амінокислотну послідовність, хімічний склад кінцевих груп, ізотопний склад, молекулярні мітки, посттрансляційні модифікації та кінцеву форму препарату. Замість того, щоб покладатися виключно на пептиди, виділені природним шляхом, або на рекомбінантну експресію, лабораторія може визначити цільову послідовність і отримати хімічно синтезований матеріал, що відповідає конкретному експериментальному завданню.
Така гнучкість дозволяє проводити дослідження в таких галузях, як молекулярна біологія, біохімія, імунологія, структурна біологія, протеоміка, діагностика, біоматеріали та розробка лікарських препаратів на ранніх етапах. Дослідники можуть замовити короткий антигенний фрагмент для розробки антитіл, фосфорильовану послідовність для ферментативного аналізу, флуоресцентний зонд для мікроскопії або набір споріднених аналогів для аналізу «структура-активність».
Сучасний синтез пептидів на замовлення зазвичай базується на методі твердофазного синтезу пептидів, який зазвичай скорочують як SPPS. У цьому методі хіміки послідовно збирають послідовність, при цьому пептид, що утворюється, залишається приєднаним до нерозчинної смоли. SPPS на основі Fmoc став широко використовуваним методом, оскільки він дозволяє відокремити тимчасову N-кінцеву захисну групу від чутливої до кислоти захисної групи бічного ланцюга та відокремлення від смоли.
Однак жоден метод синтезу не є однаково ефективним для всіх послідовностей. На можливість реалізації проекту можуть впливати такі фактори, як довжина, гідрофобність, розподіл зарядів, схильність до агрегації, амінокислотний склад, структура кінцевих груп, тип модифікації, необхідний рівень чистоти та бажана кількість. Тому ефективна реалізація проекту починається з аналізу послідовності, а не з автоматичного розрахунку вартості.
У цій статті розглядаються молекулярні основи синтезу пептидів на замовлення, основний технологічний процес синтезу, відповідні сфери застосування в біологічних дослідженнях, аналітичний контроль якості, особливості зберігання, а також практичні рекомендації, які допомагають лабораторіям правильно формулювати специфікацію пептиду.
Синтез пептидів на замовлення — це контрольоване хімічне або біохімічне отримання пептиду відповідно до послідовності та технічних вимог, обраних дослідником.
Цей термін не позначає одну конкретну молекулу. Натомість він описує виробничий процес, за допомогою якого можна отримати багато різних молекул. Кожен готовий пептид має свої:
Сам пептид складається з амінокислотних залишків, з’єднаних переважно за допомогою амідних зв’язків, які частіше називають пептидними зв’язками. У традиційному хімічному синтезі карбоксильна група однієї захищеної амінокислоти вступає в реакцію з аміногрупою ланцюга, що формується. Повторення цієї реакції дозволяє створити пептидний каркас із заданою послідовністю.
У проектах зі створення індивідуальних пептидів часто зустрічаються такі скорочення:
Спеціально синтезований Пептид належить до класу пептидів або поліпептидів за умови, що його основна структура складається з амінокислотних залишків, з’єднаних пептидними зв’язками.
Проте кінцева молекула може містити компоненти, які не зустрічаються у звичайних рибосомальних білках. До таких прикладів належать D-амінокислоти, N-метильовані залишки, бета-амінокислоти, жирні кислоти, флуорофори, ланки поліетиленгліколю, біотин, хелатори, стабільні ізотопи або синтетичні сполучні ланки.
Отже, хімічний синтез дає змогу отримувати молекулярні структури, які не можна легко створити за допомогою стандартної рекомбінантної експресії. Він також дозволяє дослідникам вносити модифікацію саме в один конкретний залишок, замість того щоб отримувати суміш продуктів із різними модифікаціями.
Важливе наукове розрізнення: Синтез пептидів на замовлення — це метод виробництва, а не сам пептид, білок, гормон, вітамін, кофермент чи низькомолекулярна сполука. Задана амінокислотна послідовність та приєднані до неї хімічні групи визначають класифікацію, формулу, молекулярну масу та біологічну активність кінцевого продукту.
І пептиди, і білки містять ланцюги амінокислот, але межа між ними не визначається якоюсь однією загальновизнаною кількістю залишків. На практиці дослідники часто використовують термін “пептид” для позначення коротших хімічно доступних ланцюгів, а термін “білок” — для позначення довших ланцюгів, які утворюють більш складні просторові структури.
SPPS зазвичай підтримує синтез коротких і середньої довжини дослідних пептидів. Зі збільшенням довжини ланцюга все більшого значення набувають кумулятивні побічні реакції, неповне з’єднання, агрегація та складнощі з очищенням. У випадку довших цільових пептидів дослідники можуть синтезувати кілька фрагментів і з’єднати їх за допомогою нативного хімічного лігування або іншої стратегії хіміоселективного лігування.
Індивідуальний синтез пептидів не має єдиної молекулярної формули. Формулу необхідно розраховувати на основі точної послідовності, кінцевих груп, протиіонів та модифікацій.
Для немодифікованого лінійного пептиду центральну структурну схему можна зобразити так:
H₂N–CHR₁–CO–NH–CHR₂–CO–NH–CHR₃–COOH
Кожна група “R” представляє бічну ланцюг однієї амінокислоти. Під час утворення пептидного зв’язку реагуючі аміно- та карбоксильні групи втрачають атоми води. Отже, молекулярну масу пептиду неможливо обчислити шляхом простого додавання мас вільних амінокислот без урахування конденсації.
Наведені нижче характеристики впливають на кінцеву молекулярну формулу або виміряну масу:
Наприклад, утворення одного внутрішньомолекулярного дисульфідного зв’язку призводить до окислення двох тіольних груп цистеїну та видалення двох атомів водню з молекулярної формули. Водночас фосфорилювання додає фосфатну групу та зумовлює появу додаткової кислотності, що може впливати на синтез, очищення та розчинність.
Два пептиди з однаковою кількістю залишків можуть поводитися зовсім по-різному. Збалансована, розчинна послідовність із 20 залишків може утворювати чітку структуру, тоді як інший пептид із 20 залишків може інтенсивно агрегувати на смолі або коелюювати разом із домішками-делеціями.
Останні дослідження й надалі вказують на те, що амінокислотний склад та агрегація ланцюгів є основними причинами ускладненого процесу сполучення під час SPPS. Утворення аспартіміду, окислення, рацемізація, утворення дикетопіперазину, неповне зняття захисних груп та реакції бічних ланцюгів також можуть знижувати якість сировини.
У ході технічного огляду слід перевірити:
Цей огляд не дозволяє передбачити всі можливі результати. Проте він допомагає хіміку вибрати смолу, схему захисних груп, стратегію сполучення, умови розщеплення, метод очищення та план аналізу.
У технології SPPS цільовий пептид з’єднується з нерозчинним полімерним носієм за допомогою першої захищеної амінокислоти або відповідного лінкера. Функціональність С-кінця визначається смолою.
Наприклад, одна хімічна структура смоли може вивільняти пептид із вільною карбоновою кислотою на С-кінці, тоді як інша — утворювати амід на С-кінці. Ступінь навантаження смоли також впливає на локальну щільність ланцюгів. Дуже високе навантаження може посилити міжмолекулярну агрегацію у випадку складних послідовностей, тому в деяких проектах смоли з меншим навантаженням можуть покращити доступність.
Процес Fmoc-SPPS зазвичай складається з повторюваного циклу:
Метод SPPS утримує ланцюг, що утворюється, на носії, що дозволяє надлишковим розчинним реагентам видалятися шляхом промивання та фільтрації. Ця експлуатаційна перевага сприяла тому, що метод SPPS став домінуючим у багатьох пептидних проектах науково-дослідного масштабу.
Незначні зниження ефективності окремих етапів сполучення накопичуються протягом довгої послідовності. Для ілюстрації: 29 етапів сполучення, виконаних з ефективністю 991 TP3T, дадуть приблизно 74,71 TP3T теоретичного матеріалу повної довжини до врахування зняття захисних груп, розщеплення, маніпуляцій та побічних реакцій. При ефективності 981 TP3T на крок теоретичний показник знижується приблизно до 55,71 TP3T. Цей математичний ефект пояснює, чому складні послідовності можуть утворювати комплексні сирі суміші навіть тоді, коли більшість окремих реакцій протікають успішно.
Після додавання останнього залишку за допомогою розщеплювальної суміші пептид вивільняється з смоли, а кислотнолабільні захисні групи бічних ланцюгів видаляються. Неочищений матеріал може містити:
Отже, успішне складання ланцюга не означає автоматично, що готовий матеріал досяг необхідного рівня чистоти.
Вершинофазна ВЕРХ розділяє пептидні компоненти залежно від їхньої взаємодії зі стаціонарною фазою та градієнтом рухомої фази. Цей метод залишається одним із найбільш універсальних для очищення пептидів та їх аналітичної оцінки.
Після очищення отриману фракцію можуть піддавати концентруванню, регулюванню вмісту протиіонів, у разі необхідності — стерильній фільтрації, а також ліофілізації. Кінцевою фізичною формою може бути пухкий порошок, щільний брикет, плівка або частково аморфна тверда речовина. Зовнішній вигляд сам по собі не може підтвердити ідентичність або чистоту речовини.
Синтез пептидів на замовлення не відіграє жодної самостійної біологічної ролі. Натомість він надає лабораторіям доступ до певних пептидів, за допомогою яких можна досліджувати біологічні механізми.
Дослідники можуть синтезувати фрагменти, що зв’язуються з рецепторами, укорочені аналоги, варіанти із заміною аланіну або модифіковані ліганди. Порівняння їхньої активності дозволяє з’ясувати, які залишки впливають на афінність зв’язування, активацію рецептора, селективність або антагонізм.
Синтетичні пептиди часто виступають субстратами для кіназ, фосфатаз, протеаз, ацетилтрансфераз, деацетилаз та інших ферментів. У лабораторії можна розмістити потенційний мотив розпізнавання всередині контрольованої послідовності та виміряти утворення продукту або втрату субстрату.
Лінійні пептиди, отримані на основі амінокислотної послідовності білка, можуть використовуватися для синтезу антитіл, картування епітопів, контролю аналізів та досліджень конкуренції. Однак лінійний пептид може не відтворювати конформаційний епітоп, який залежить від конформації білка або віддалених залишків.
Модифіковані пептиди можуть імітувати стани фосфорилювання, ацетилювання, метилювання або протеолітичної обробки. Після цього дослідники можуть вивчити, як певний молекулярний стан впливає на зв’язування, локалізацію, розпізнавання ферментами або подальшу передачу сигналу.
Пептиди з визначеною послідовністю можуть утворювати волокна, пластини, наночастинки, гідрогелі або інші надмолекулярні структури. Оскільки процес самоорганізації значною мірою залежить від послідовності, заряду, концентрації, рН, температури та умов розчинника, кожна система матеріалів вимагає окремої характеристики. Наприклад, одне скринінгове дослідження, проведене за методом OBOC, дозволило виявити самоорганізовані пентапептиди з набагато ширшого простору послідовностей, замість того щоб виходити з припущення, що всі короткі пептиди будуть самоорганізовуватися однаково.
Лабораторії використовують пептиди, синтезовані на замовлення, коли для вирішення дослідницького завдання потрібна молекула, яка:
Серед сфер застосування — кінетика ферментів, аналізи зв’язування, дослідження клітинних культур, імунологічні аналізи, протеоміка, структурний аналіз, афінне очищення, мікроскопія, дослідження біомаркерів та розробка доклінічних моделей.
Припустимо, що дослідницька група хоче з’ясувати, чи розпізнає білковий домен фосфорильований сериновий мотив.
Ефективний план проекту може включати:
Ця схема дозволяє відокремити зв’язування, що залежить від модифікацій, від ефектів приєднання, незалежних від послідовності. Крім того, одночасне проведення контрольних випробувань знижує ризик того, що відмінності між партіями або в обробці зразків ускладнять інтерпретацію результатів.
У наведеній нижче таблиці узагальнено загальні наукові відмінності. Реальність реалізації конкретного проєкту все ще залежить від вимог до послідовності, масштабу, структури та модифікацій. Хімічний синтез забезпечує особливо прямий доступ до неканонічних залишків та модифікацій у визначених місцях, тоді як рекомбінантна експресія часто виявляється більш практичною для значно більших білків.
| Параметр | Синтез хімічних речовин на замовлення | Рекомбінантна експресія |
|---|---|---|
| Клас товару | Синтетичний пептид або поліпептид із визначеною послідовністю | Біологічно синтезований пептид або білок |
| Основне формування зв’язків | Поетапне хімічне утворення амідного зв’язку | Утворення пептидних зв’язків у рибосомах |
| Напрямок послідовності | Зазвичай від С-кінця до Н-кінця | Від N-кінця до C-кінця |
| Неканонічні залишки | Часто доступні безпосередньо | Потрібні спеціалізовані біологічні методи |
| Модифікація, специфічна для конкретного місця | Може встановлюватися у визначеному місці | Може знадобитися ферментативна або клітинна обробка |
| Типова міцність | Модифіковані послідовності короткої або середньої довжини | Довші згорнуті білки та більші кількості |
| Перевірка особи | МС або ЛК-МС у поєднанні з іншими методами | МС, секвенування, електрофорез та аналізи згортання білків |
| Основна відмінність | Хімічний контроль окремих залишків | Виробництво генетично закодованих ланцюгів на основі клітин |
Стабільність пептидів залежить від їхньої амінокислотної послідовності та форми випуску. Не існує єдиних правил зберігання, які б підходили для всіх пептидів, виготовлених на замовлення.
Згідно із загальним лабораторним принципом, сухі пептиди зазвичай краще переносять зберігання, ніж водні розчини пептидів. Волога, кисень, світло, багаторазове нагрівання, екстремальні значення рН, протеази та цикли заморожування–розморожування можуть прискорювати хімічні або фізичні зміни. Опубліковані рекомендації щодо пептидних еталонів також наголошують на необхідності розливу на аліквоти, контрольованого поводження з речовиною, кількісного визначення, що відповідає призначенню, та мінімізації багаторазового впливу циклів заморожування–розморожування.
Тримайте флакон закритим, поки він нагріється до кімнатної температури. Якщо відкрити холодний флакон одразу, на порошку може утворитися конденсат від вологи з повітря.
Для тривалого зберігання зазвичай застосовують умови заморожування, найчастіше при температурі близько −20 °C або нижче, хоча конкретні умови повинні відповідати даним щодо стабільності конкретної послідовності та наданій документації.
Вибір розчинника повинен залежати від заряду та гідрофобності, а не від універсальної схеми. Для пептиду з високим зарядом може підійти вода, тоді як для гідрофобної послідовності може знадобитися невелика кількість органічного співрозчинника перед поступовим розведенням у експериментальному буфері.
Лабораторія також повинна переконатися, що кінцевий склад розчинника залишається сумісним із методом аналізу. Розчин, який ефективно розчиняє пептид, все одно може порушувати цілісність клітин, ферментів, мембран або впливати на результати вимірювання зв’язування.
Перед відкриттям флакона переконайтеся, що послідовність, кінцеві групи, модифікації, протиіон, результат аналізу чистоти, молекулярна маса та кількість у комплекті відповідають зазначеним.
Не слід вважати, що сама лише назва продукту визначає його хімічну структуру.
Зберігайте герметично закритий флакон при кімнатній температурі до досягнення рівноваги в контейнері.
Не слід відразу відкривати заморожений флакон, оскільки внаслідок конденсації може потрапити неконтрольована волога.
Оцініть заряд та гідрофобність пептиду, а потім оберіть відповідний вихідний розчинник.
Не додавайте великий об’єм рідини, доки не переконаєтеся, що пептид повністю розчинився.
Додайте частину розчинника, обережно перемішайте, перевірте розчин і, за необхідності, продовжуйте розведення.
Уникайте сильного піноутворення або тривалого впливу зайвого тепла.
Розділіть розчин відповідно до передбачуваного експериментального використання.
Не слід зберігати весь обсяг проекту в одній пробірці, до якої доводиться постійно звертатися.
Вкажіть, чи для розрахунку концентрації використовується вага порошку брутто, вміст пептиду чи концентрація, визначена окремо.
Не слід ототожнювати хроматографічну чистоту з чистим вмістом пептиду.
У разі необхідності захищайте світлочутливі або схильні до окислення послідовності та дотримуйтесь рекомендацій щодо зберігання, визначених для конкретного проєкту.
Не варто покладатися на пробірку без етикетки або на місце зберігання в морозильній камері, яке не задокументовано.
Надійна система контролю якості передбачає застосування взаємодоповнюючих методів, оскільки жоден окремий тест не дає відповіді на всі питання.
Аналітична RP-HPLC дозволяє оцінити хроматографічну чистоту за допомогою визначеної методики. Вона дозволяє виявити головний пік та супутні домішки, які розділяються за цих умов.
Однак сам по собі час утримання за методом ВЕРХ не є доказом молекулярної ідентичності. Сполуки, що елююють одночасно, також можуть знизити точність результату, отриманого за допомогою простого розрахунку відсоткової частки площі.
МС порівнює отримані сигнали «маса-заряд» з очікуваною молекулярною масою. Це дає переконливі докази ідентичності молекули та дозволяє виявляти деякі укорочення, аддукти, продукти окислення або помилки модифікації.
Проте сама по собі правильна молекулярна маса не є доказом хроматографічної чистоти, точного порядку амінокислот у послідовності, стереохімічної цілісності або абсолютного вмісту пептиду.
LC-MS поєднує хроматографічне розділення з масованим аналізом. Завдяки цьому ця методика дозволяє пов’язати конкретні піки з їхніми виміряними масами та надає більше інформації, ніж кожна з цих методик окремо.
Аналіз амінокислот може допомогти у визначенні складу та вмісту пептидів. У відповідних проектах також можуть бути корисними кількісні методи ЯМР або калібровані спектроскопічні методи.
Основні платформи для синтезу на замовлення зазвичай поєднують аналітичну ВЕРХ з масс-спектрометрією, а не використовують один метод як єдиний засіб оцінки якості.
Синтез пептидів на замовлення — це контрольоване виготовлення пептиду відповідно до визначеної дослідником амінокислотної послідовності та технічних вимог. Технічні вимоги можуть включати кінцеві групи, ступінь чистоти, кількість, мічення, фосфорилювання, циклізацію, ізотопне збагачення або інші модифікації пептиду. У більшості науково-дослідних проектів використовується SPPS, хоча для окремих цілей можуть бути доцільними LPPS, лігація фрагментів, рекомбінантне виробництво або гібридні стратегії.
Ні. Синтез пептидів на замовлення — це виробничий процес, а не окрема хімічна речовина. Продуктом цього процесу є пептид. Отже, синтез пептидів на замовлення не має єдиної молекулярної формули, молекулярної маси, біологічної функції чи температури зберігання. Ці властивості визначаються кінцевою послідовністю та її модифікаціями.
Молекулярна маса залежить від амінокислотної послідовності, хімічного складу кінцевих груп, ковалентних модифікацій, ізотопного складу, ступеня окиснення та форми протиіона. Теоретичну нейтральну масу можна розрахувати на основі повної структури. Потім за допомогою мас-спектрометрії слід підтвердити, що спостережуваний продукт відповідає очікуваній молекулярній масі або співвідношенню маси до заряду.
У процесі SPPS зростаючий пептид утримується на нерозчинній смолі, тоді як розчинні реагенти та побічні продукти видаляються шляхом промивання. Завдяки цьому хіміки можуть повторювати цикли дезахисту та сполучення, не виділяючи кожен проміжний продукт. Цей підхід також дозволяє автоматизувати процес і застосовувати широкий спектр захищених амінокислот та модифікацій.
Складнощі можуть виникати через довжину, агрегацію, гідрофобність, повторювані залишки, стеричні перешкоди, нестабільні модифікації, залишки, схильні до окислення, неповне з’єднання, утворення аспартиміду, рацемізацію або недостатнє хроматографічне розділення. Крім того, синтез і очищення — це окремі проблеми. Послідовність може бути зібрана належним чином, але її все одно буде важко очистити.
Відповідь залежить від конкретного експерименту. Для попереднього скринінгу може бути прийнятним нижчий рівень чистоти, тоді як для кількісного визначення зв’язування, структурного аналізу, чутливих клітинних тестів, аналітичних стандартів або імунологічних досліджень може знадобитися матеріал з більш високим ступенем очищення. Дослідники повинні обирати рівень чистоти, виходячи з того, як відповідні домішки можуть вплинути на результат, а не автоматично вибирати найвищий із доступних показників.
Ні. Чистота, визначена методом ВЕРХ, зазвичай виражається як відносна площа хроматографічних піків, виявлених за допомогою визначеної методики. Чистий вміст пептиду показує, скільки фактично пептиду міститься у зваженому матеріалі після вирахування води, протиіонів, залишків розчинників та інших непептидних компонентів. Ці два показники дають відповіді на різні питання.
Так. У ході хімічного синтезу можна використовувати багато захищених неканонічних залишків, D-амінокислот, N-метильованих залишків, бета-амінокислот, ізотопно мічених залишків та інших будівельних блоків. Можливість їхнього використання все ж залежить від доступності будівельних блоків, їхньої хімічної стабільності, ефективності з’єднання та сумісності з подальшими етапами розщеплення або модифікації.
Розчинність слід оцінювати з урахуванням конкретної послідовності. Заряджені пептиди можуть розчинятися у воді або відповідному буфері, тоді як гідрофобні пептиди можуть потребувати невеликої кількості органічного співрозчинника. Кінцевий розчинник повинен залишатися сумісним з умовами експерименту. Застосування універсального протоколу реконституції може призвести до утворення осаду або перешкод у проведенні аналізу.
Сухі пептиди зазвичай зберігають у замороженому стані, захищаючи їх від вологи та світла відповідно до вимог. Розчинений матеріал, як правило, слід розділити на аліквоти для одноразового використання та зберігати відповідно до умов, визначених для конкретної послідовності. Повторні цикли заморожування-розморожування, окислення, екстремальні значення рН, протеази та тривале перебування при кімнатній температурі можуть погіршити цілісність зразка.
Аналітична ВЕРХ дозволяє оцінити хроматографічну чистоту, а МС або ЛХ-МС — підтвердити молекулярну масу. Аналіз амінокислот допомагає оцінити склад і вміст речовин. Залежно від проекту лабораторіям можуть також знадобитися ЯМР, капілярний електрофорез, оптичний аналіз, тестування на ендотоксини, тестування на залишки розчинників, аналіз води або функціональний аналіз.
Ні. Хімічна структура та чистота не визначають автоматично клітинну проникність, біологічну активність, стабільність або сумісність з методами аналізу. Дослідники повинні враховувати послідовність пептиду, його заряд, властивості агрегації, систему розчинників, концентрацію, експериментальну модель, контрольні групи та передбачуваний біологічний механізм дії.
Синтез пептидів на замовлення — це процес виготовлення, що базується на послідовності, який надає лабораторіям можливість точного контролю над молекулярною структурою. SPPS залишається основною платформою для багатьох дослідних пептидів, тоді як LPPS, лігація фрагментів та гібридні методи розширюють можливості щодо отримання пептидів інших класів послідовностей.
Саме кінцевий пептид — а не сам процес синтезу — має молекулярну формулу, молекулярну масу, біологічну функцію та характеристики стабільності. Тому науково обґрунтований проект починається з аналізу послідовності і продовжується етапами синтезу, очищення, перевірки ідентичності, аналізу чистоти, оцінки вмісту та документованого поводження з речовиною.
Ретельне визначення технічних характеристик також сприяє кращому тлумаченню результатів експериментів. До початку виробництва дослідники повинні визначити передбачуваний аналіз, відповідні контрольні зразки, кінцеву хімічну обробку, модифікації пептидів, рівень чистоти, кількість та аналітичні вимоги.
Тільки для наукових досліджень. Не призначено для застосування у людей.
