Синтез пептидов по индивидуальному заказу позволяет исследователям напрямую контролировать аминокислотную последовательность, химический состав концевых групп, изотопный состав, молекулярные метки, посттрансляционные модификации и конечную форму препарата. Вместо того чтобы полагаться исключительно на пептиды, выделенные из природных источников, или на рекомбинантную экспрессию, лаборатория может определить целевую последовательность и получить химически синтезированный материал, отвечающий конкретной экспериментальной задаче.
Такая гибкость позволяет вести исследования в таких областях, как молекулярная биология, биохимия, иммунология, структурная биология, протеомика, диагностика, биоматериалы и ранние этапы разработки лекарственных препаратов. Исследователи могут заказать короткий антигенный фрагмент для разработки антител, фосфорилированную последовательность для ферментативного анализа, флуоресцентный зонд для микроскопии или набор родственных аналогов для анализа «структура-активность».
Современный синтез пептидов на заказ обычно основан на методе твердофазного синтеза пептидов, который обычно сокращенно называют SPPS. При этом методе химики пошагово собирают последовательность, при этом формирующийся пептид остается присоединенным к нерастворимой смоле. SPPS на основе Fmoc стал широко используемым подходом, поскольку он позволяет разделить временную N-концевую защиту от защиты боковых цепей, чувствительной к кислоте, и отщепления от смолы.
Однако ни один метод синтеза не обеспечивает одинаково высокую эффективность для всех последовательностей. На осуществимость проекта могут влиять такие факторы, как длина, гидрофобность, распределение зарядов, склонность к агрегации, аминокислотный состав, структура концевых групп, тип модификации, требуемый уровень чистоты и запрашиваемый объем. Поэтому эффективная реализация проекта начинается с анализа последовательности, а не с автоматического расчета стоимости.
В данной статье рассматриваются молекулярные основы синтеза пептидов по индивидуальному заказу, основной технологический процесс синтеза, соответствующие области применения в биологических исследованиях, аналитический контроль качества, рекомендации по хранению, а также практические рекомендации, помогающие лабораториям правильно сформулировать техническое задание на синтез пептида.
Синтез пептидов по индивидуальному заказу — это контролируемый химический или биохимический процесс получения пептида в соответствии с последовательностью и техническими характеристиками, выбранными исследователем.
Этот термин не обозначает какую-то одну молекулу. Напротив, он описывает производственный процесс, в ходе которого могут получаться многие различные молекулы. Каждый готовый пептид имеет свои собственные:
Сам по себе пептид состоит из аминокислотных остатков, соединенных в основном через амидные связи, которые чаще называют пептидными связями. При традиционном химическом синтезе карбоксильная группа одной защищенной аминокислоты вступает в реакцию с аминогруппой формирующейся цепи. Повторение этой реакции приводит к образованию пептидного остова с заданной последовательностью.
В проектах по созданию пептидов на заказ часто встречаются следующие сокращения:
Синтезированный по индивидуальному заказу Пептид относится к классу пептидов или полипептидов при условии, что его основная структура состоит из аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями.
Тем не менее конечная молекула может содержать компоненты, которые не встречаются в обычных рибосомных белках. К ним относятся, например, D-аминокислоты, N-метилированные остатки, бета-аминокислоты, жирные кислоты, флуорофоры, звенья полиэтиленгликоля, биотин, хелаторы, стабильные изотопы или синтетические линкеры.
Таким образом, химический синтез позволяет создавать молекулярные структуры, которые с помощью стандартной рекомбинантной экспрессии получить не так просто. Кроме того, он дает исследователям возможность вносить модификацию в один конкретный аминокислотный остаток, вместо того чтобы получать смесь продуктов с различными модификациями.
Важное научное различие: Синтез пептидов по индивидуальному заказу — это метод производства, а не сам пептид, белок, гормон, витамин, кофермент или низкомолекулярное соединение. Заданная аминокислотная последовательность и присоединенные к ней химические группы определяют классификацию, формулу, молекулярную массу и биологические свойства конечного продукта.
И пептиды, и белки состоят из цепей аминокислот, однако граница между ними не определяется каким-либо единым для всех количеством аминокислотных остатков. На практике исследователи часто используют термин “пептид” для обозначения более коротких химически доступных цепей, а термин “белок” — для более длинных цепей, принимающих более сложные свернутые структуры.
Метод SPPS обычно подходит для синтеза коротких и средней длины исследовательских пептидов. По мере увеличения длины цепи все большее значение приобретают кумулятивные побочные реакции, неполные соединения, агрегация и сложность очистки. В случае более длинных целевых пептидов исследователи могут синтезировать несколько фрагментов и соединить их с помощью нативной химической лигации или другой стратегии хемоселективной лигации.
У индивидуального синтеза пептидов нет единой молекулярной формулы. Формулу необходимо рассчитывать на основе точной последовательности, концевых групп, противоионов и модификаций.
Для немодифицированного линейного пептида центральный структурный мотив можно представить следующим образом:
H₂N–CHR₁–CO–NH–CHR₂–CO–NH–CHR₃–COOH
Каждая группа “R” представляет собой боковую цепь одной аминокислоты. В процессе образования пептидной связи реагирующие амино- и карбоксильные группы теряют атомы воды. Следовательно, молекулярную массу пептида нельзя рассчитать путем простого сложения масс свободных аминокислот без учета конденсации.
Следующие параметры влияют на окончательную молекулярную формулу или измеренную массу:
Например, при образовании одной внутримолекулярной дисульфидной связи происходит окисление двух тиольных групп цистеина и удаление двух атомов водорода из молекулярной формулы. В то же время при фосфорилировании добавляется фосфатсодержащая группа, что приводит к появлению дополнительной кислотности, которая может влиять на синтез, очистку и растворимость.
Два пептида с одинаковым количеством аминокислотных остатков могут вести себя совершенно по-разному. Сбалансированная, растворимая последовательность из 20 остатков может формировать четкую структуру, в то время как другой пептид из 20 остатков может интенсивно агрегировать на смоле или коэлюировать с примесями-делециями.
В последних исследованиях по-прежнему выделяются аминокислотный состав и агрегация цепей в качестве основных причин затруднений при соединении в процессе SPPS. Образование аспартимида, окисление, рацемизация, образование дикетопиперазина, неполное удаление защитных групп и реакции боковых цепей также могут снижать качество сырого продукта.
В рамках технической экспертизы следует рассмотреть следующие вопросы:
Данный обзор не позволяет предсказать все возможные результаты. Однако он помогает химику выбрать смолу, схему защитных групп, стратегию соединения, условия отщепления, метод очистки и план аналитических исследований.
В методе SPPS целевой пептид соединяется с нерастворимым полимерным носителем с помощью первой защищенной аминокислоты или подходящего линкера. Функциональность С-конца определяется смолой.
Например, одна химическая модификация смолы может приводить к высвобождению пептида со свободной карбоксильной группой на С-конце, тогда как другая — к образованию амида на С-конце. Степень насыщения смолы также влияет на локальную плотность цепей. Очень высокая степень насыщения может усиливать межмолекулярную агрегацию для сложных последовательностей, поэтому в некоторых проектах смолы с более низкой степенью насыщения могут улучшить доступность.
Процесс Fmoc-SPPS обычно проходит в виде повторяющегося цикла:
При методе SPPS растущая цепь удерживается на смоле, что позволяет удалить избыток растворимых реагентов посредством промывки и фильтрации. Это операционное преимущество способствовало тому, что метод SPPS стал доминирующим подходом для реализации многих исследовательских проектов по синтезу пептидов.
Незначительные снижения эффективности отдельных стадий соединения накапливаются на протяжении длинной последовательности. В качестве наглядного примера можно привести следующий расчет: 29 стадий соединения, выполненных с эффективностью 99%, дадут примерно 74,7% теоретического материала полной длины до учета депротекции, расщепления, манипуляций и побочных реакций. При эффективности 981 TP3T на этап теоретическое значение снижается примерно до 55,71 TP3T. Этот математический эффект объясняет, почему сложные последовательности могут приводить к образованию сложных сырых смесей, даже если большинство отдельных реакций протекают успешно.
После добавления последнего остатка с помощью смеси для отщепления пептид высвобождается из смолы, а кислотолабильные защитные группы боковых цепей удаляются. Неочищенный материал может содержать:
Поэтому успешная сборка цепи не означает автоматически, что готовый материал достиг требуемой степени чистоты.
Вернутофазная ВЭЖХ позволяет разделять пептидные компоненты в зависимости от их взаимодействия с стационарной фазой и градиентом подвижной фазы. Этот метод по-прежнему остается одним из наиболее универсальных способов очистки пептидов и их аналитической оценки.
После очистки полученная фракция может подвергаться концентрированию, регулированию содержания противоионов, стерильной фильтрации (при необходимости) и лиофилизации. Конечной физической формой может быть рыхлый порошок, плотный прессованный брусок, пленка или частично аморфное твердое вещество. Внешний вид сам по себе не может служить подтверждением идентичности или чистоты.
Синтез пептидов по индивидуальному заказу не играет никакой самостоятельной биологической роли. Вместо этого он предоставляет лабораториям доступ к определённым пептидам, которые позволяют исследовать биологические механизмы.
Исследователи могут синтезировать фрагменты, связывающиеся с рецептором, укороченные аналоги, варианты с заменой аланина или модифицированные лиганды. Сравнение их активности позволяет выявить, какие остатки влияют на аффинность связывания, активацию рецептора, селективность или антагонизм.
Синтетические пептиды часто выступают в качестве субстратов для киназ, фосфатаз, протеаз, ацетилтрансфераз, деацетилаз и других ферментов. В лабораторных условиях можно встроить потенциальный мотив распознавания в контролируемую последовательность и измерить образование продукта или расход субстрата.
Линейные пептиды, полученные на основе аминокислотной последовательности белка, могут использоваться для получения антител, картирования эпитопов, контроля анализов и проведения исследований конкуренции. Однако линейный пептид может не воспроизводить конформационный эпитоп, который зависит от структуры белка или удаленных остатков.
Модифицированные пептиды могут имитировать состояния фосфорилирования, ацетилирования, метилирования или протеолитической обработки. Затем исследователи могут изучить, как определённое молекулярное состояние влияет на связывание, локализацию, распознавание ферментами или последующую передачу сигналов.
Пептиды с заданной последовательностью могут образовывать волокна, пленки, наночастицы, гидрогели или другие супрамолекулярные структуры. Поскольку процесс самосборки в значительной степени зависит от последовательности, заряда, концентрации, pH, температуры и условий растворителя, каждая система материалов требует отдельной характеристики. Например, в одном скрининговом исследовании, проведенном в рамках проекта OBOC, были выявлены самосборные пентапептиды из гораздо более обширного пространства последовательностей, вместо того чтобы исходить из предположения, что все короткие пептиды собираются одинаково.
Лаборатории используют пептиды, синтезированные по индивидуальному заказу, когда для решения исследовательской задачи требуется молекула, которая:
Области применения включают кинетику ферментативных реакций, анализы связывания, исследования клеточных культур, иммуноанализы, протеомику, структурный анализ, аффинную очистку, микроскопию, исследования биомаркеров и разработку доклинических моделей.
Предположим, что исследовательская группа хочет выяснить, распознает ли белковый домен мотив фосфорилированного серина.
Эффективный проект может включать:
Данная схера позволяет отделить связывание, зависящее от модификаций, от эффектов присоединения, не зависящих от последовательности. Кроме того, одновременное проведение контрольных экспериментов снижает риск того, что различия между партиями или в условиях обработки затруднят интерпретацию результатов.
В приведенной ниже таблице обобщены общие научные различия. Возможность реализации конкретного проекта по-прежнему зависит от требований к последовательности, масштабу, структуре и модификациям. Химический синтез обеспечивает особенно прямой доступ к неканоническим остаткам и модификациям с определённой позицией, тогда как рекомбинантная экспрессия зачастую оказывается более практичной для белков значительно большего размера.
| Параметр | Синтез химических веществ по индивидуальному заказу | Экспрессия рекомбинантных белков |
|---|---|---|
| Класс продукта | Синтетический пептид или полипептид с заданной последовательностью | Пептид или белок, полученный биологическим способом |
| Основное образование связей | Поэтапное химическое образование амидной связи | Образование рибосомных пептидных связей |
| Направление последовательности | Обычно от С-конца к N-концу | От N-конца к C-концу |
| Неканонические остатки | Часто доступно напрямую | Требует применения специализированных биологических методов |
| Модификация с учетом особенностей конкретного участка | Может быть установлен в заданном положении | Может потребоваться ферментативная или клеточная обработка |
| Типичная прочность | Модифицированные последовательности короткой или средней длины | Более длинные свернутые белки и в большем количестве |
| Проверка личности | МС или ЛХ-МС в сочетании с другими методами | МС, секвенирование, электрофорез и анализы фолдинга |
| Основное отличие | Химический контроль отдельных остатков | Производство генетически закодированных цепей с использованием клеток |
Стабильность пептида зависит от его аминокислотной последовательности и формы выпуска. Не существует единого правила хранения, применимого ко всем пептидам, изготовленным по индивидуальному заказу.
В соответствии с общими лабораторными принципами сухие пептиды, как правило, лучше переносят хранение, чем водные растворы пептидов. Влага, кислород, свет, многократное нагревание, экстремальные значения pH, протеазы и циклы замораживания–размораживания могут ускорять химические или физические изменения. В опубликованных рекомендациях по стандартам пептидов также подчеркивается важность разлива на аликвоты, контролируемого обращения, количественного определения, соответствующего целям исследования, и минимизации многократного воздействия циклов замораживания-размораживания.
Держите флакон закрытым, пока он не нагреется до комнатной температуры. Если сразу открыть холодный флакон, на порошке может образоваться конденсат из атмосферной влаги.
Для длительного хранения обычно используются условия замораживания, зачастую при температуре около −20 °C или ниже, хотя конкретные условия должны определяться с учетом данных о стабильности конкретной последовательности и прилагаемой документации.
При выборе растворителя следует ориентироваться на заряд и гидрофобность, а не руководствоваться каким-либо универсальным рецептом. Для пептида с высоким зарядом может подойти вода, тогда как для гидрофобной последовательности может потребоваться небольшое количество органического сорастворителя перед постепенным разбавлением в экспериментальном буфере.
Лаборатория также должна убедиться, что конечный состав растворителя по-прежнему совместим с данным анализом. Раствор, который эффективно растворяет пептид, может при этом разрушать клетки, ферменты, мембраны или влиять на результаты измерения связывания.
Перед вскрытием флакона необходимо проверить последовательность, концы цепи, модификации, противоион, результат анализа чистоты, молекулярную массу и поставляемое количество.
Не следует полагать, что одно только название продукта определяет его химическую структуру.
Храните запечатанный флакон при комнатной температуре до тех пор, пока в контейнере не установится равновесие.
Не следует сразу же открывать замороженный флакон, так как в результате образования конденсата в него может попасть неконтролируемое количество влаги.
Оцените заряд и гидрофобность пептида, а затем выберите подходящий исходный растворитель.
Не добавляйте большой объем жидкости, пока не убедитесь, что пептид растворился.
Добавьте часть растворителя, аккуратно перемешайте, проверьте раствор и при необходимости продолжите разбавление.
Не допускайте интенсивного вспенивания или длительного воздействия излишнего тепла.
Разделите раствор в соответствии с предполагаемым экспериментальным назначением.
Не следует хранить весь объем проекта в одной пробирке, к которой постоянно обращаются.
Укажите, используются ли при расчёте концентрации вес порошка брутто, содержание пептида или независимо измеренная концентрация.
Не следует приравнивать хроматографическую чистоту к чистому содержанию пептида.
При необходимости защищайте светочувствительные или подверженные окислению последовательности и следуйте рекомендациям по хранению, предусмотренным для данного проекта.
Не полагайтесь на пробирки без этикеток или на место хранения в морозильной камере, не указанное в документации.
Надежная система контроля качества предусматривает использование взаимодополняющих методов, поскольку ни один отдельный тест не может дать ответ на все вопросы.
Аналитическая РП-ВЭЖХ позволяет оценить хроматографическую чистоту в соответствии с установленной методикой. С её помощью можно определить основной пик и сопутствующие примеси, которые разделяются в данных условиях.
Однако само по себе время удержания при ВЭЖХ не является доказательством молекулярной идентичности. Соединения, элюирующиеся одновременно, также могут снизить точность результата, полученного методом расчета процентного содержания по площади.
МС сравнивает наблюдаемые сигналы «масса-заряд» с расчетной массой молекулы. Это дает убедительные доказательства идентичности молекулы и позволяет выявлять некоторые усечения, аддукты, продукты окисления или ошибки при модификации.
Тем не менее, правильное значение молекулярной массы само по себе не свидетельствует о хроматографической чистоте, точном порядке аминокислотных остатков, стереохимической целостности или абсолютном содержании пептида.
Метод LC-MS сочетает в себе хроматографическое разделение с масс-спектрометрическим детектированием. Благодаря этому он позволяет соотнести отдельные пики с их измеренными массами и предоставляет больше информации, чем каждая из этих методик в отдельности.
Анализ аминокислот может помочь в определении состава и содержания пептидов. В соответствующих проектах также могут оказаться полезными количественные методы ЯМР или калиброванные спектроскопические методы.
Крупные платформы по синтезу на заказ, как правило, сочетают аналитическую ВЭЖХ с масс-спектрометрией, а не используют один метод в качестве единственного средства оценки качества.
Синтез пептидов на заказ — это контролируемое производство пептида в соответствии с аминокислотной последовательностью и техническими требованиями, определёнными исследователем. Технические требования могут включать концевые группы, степень чистоты, количество, мечение, фосфорилирование, циклизацию, изотопное обогащение или другие модификации пептида. В большинстве исследовательских проектов используется SPPS, хотя для конкретных целей могут подойти LPPS, лигирование фрагментов, рекомбинантное производство или гибридные стратегии.
Нет. Синтез пептидов на заказ — это производственный процесс, а не какое-либо конкретное химическое вещество. Продуктом этого процесса является пептид. Следовательно, у синтеза пептидов на заказ нет единой молекулярной формулы, молекулярной массы, биологической функции или температуры хранения. Эти свойства зависят от конечной аминокислотной последовательности и её модификаций.
Молекулярная масса зависит от аминокислотной последовательности, химического состава концевых групп, ковалентных модификаций, изотопного состава, степени окисления и формы противоиона. Теоретическую нейтральную массу можно рассчитать на основе полной структуры. Затем с помощью масс-спектрометрии следует подтвердить, что наблюдаемый продукт соответствует ожидаемой молекулярной массе или соотношению «масса-заряд».
В процессе SPPS растущий пептид удерживается на нерастворимой смоле, в то время как растворимые реагенты и побочные продукты удаляются в ходе промывки. Благодаря этому химики могут повторять циклы дезащиты и соединения, не выделяя каждый промежуточный продукт. Данный подход также позволяет автоматизировать процесс и использовать широкий спектр защищенных аминокислот и модификаций.
Сложности могут возникать из-за длины, агрегации, гидрофобности, повторяющихся остатков, стерического препятствия, нестабильных модификаций, остатков, склонных к окислению, неполного соединения, образования аспартимида, рацемизации или плохого хроматографического разделения. Кроме того, синтез и очистка представляют собой отдельные проблемы. Последовательность может быть собрана надлежащим образом, но при этом оставаться трудноочищаемой.
Ответ зависит от конкретного эксперимента. При предварительном скрининге допускается более низкая степень очистки, тогда как для количественного определения связывания, структурного анализа, чувствительных клеточных анализов, аналитических стандартов или иммунологических исследований может потребоваться материал более высокой степени очистки. Исследователям следует выбирать степень очистки исходя из того, какое влияние сопутствующие примеси могут оказать на результат, а не автоматически выбирать максимально возможный показатель.
Нет. Чистота, определяемая методом ВЭЖХ, обычно выражается в виде относительной площади хроматографических пиков, зарегистрированных в соответствии с установленной методикой. Содержание чистого пептида показывает, какое количество фактического пептида содержится в взвешенном материале с учетом воды, противоионов, остаточных растворителей и других непептидных компонентов. Эти два показателя отвечают на разные вопросы.
Да. В ходе химического синтеза можно использовать множество защищенных неканонических остатков, D-аминокислот, N-метилированных остатков, бета-аминокислот, изотопно-меченых остатков и других строительных блоков. Возможность реализации по-прежнему зависит от доступности строительных блоков, их химической стабильности, эффективности соединения, а также совместимости с последующими этапами расщепления или модификации.
Растворимость следует оценивать с учетом конкретной аминокислотной последовательности. Заряженные пептиды могут растворяться в воде или подходящем буфере, тогда как для гидрофобных пептидов может потребоваться небольшое количество органического сорастворителя. Конечный растворитель должен оставаться совместимым с условиями эксперимента. Использование универсального протокола реконституции может привести к выпадению осадка или к искажению результатов анализа.
Сухие пептиды обычно хранят в замороженном виде, защищая от влаги и света в соответствии с требованиями. Разведенный материал, как правило, следует разделить на аликвоты для однократного использования и хранить в условиях, соответствующих конкретной аминокислотной последовательности. Многократные циклы замораживания-размораживания, окисление, экстремальные значения pH, воздействие протеаз и длительное нахождение при комнатной температуре могут привести к ухудшению целостности образца.
Аналитическая ВЭЖХ позволяет оценить хроматографическую чистоту, а МС или ЖХ-МС — подтвердить молекулярную массу. Анализ аминокислот помогает оценить состав и содержание. В зависимости от проекта лабораториям могут также потребоваться ЯМР, капиллярный электрофорез, оптический анализ, определение эндотоксинов, определение остаточного растворителя, анализ воды или функциональный анализ.
Нет. Химический состав и степень чистоты не являются автоматическим гарантом клеточной проницаемости, биологической активности, стабильности или совместимости с методами анализа. Исследователи должны учитывать последовательность пептида, его заряд, склонность к агрегации, систему растворителей, концентрацию, экспериментальную модель, контрольные группы и предполагаемый биологический механизм действия.
Синтез пептидов по индивидуальному заказу — это процесс производства, ориентированный на последовательность, который обеспечивает лабораториям точный контроль над молекулярным дизайном. SPPS по-прежнему остается основной платформой для синтеза многих исследовательских пептидов, в то время как LPPS, лигирование фрагментов и гибридные методы расширяют возможности синтеза пептидов других классов последовательностей.
Именно конечный пептид — а не сам процесс синтеза — обладает молекулярной формулой, молекулярной массой, биологической функцией и характеристиками стабильности. Поэтому научно обоснованный проект начинается с анализа последовательности и продолжается этапами синтеза, очистки, проверки идентичности, анализа чистоты, оценки содержания и документированного обращения с образцами.
Тщательная проработка технического задания также способствует более точной интерпретации результатов экспериментов. Перед началом производства исследователи должны определить предполагаемый метод анализа, соответствующие контрольные пробы, конечные химические реакции, модификации пептидов, уровень чистоты, количество и аналитические требования.
Только для научных целей. Не предназначено для применения у людей.
