ペプチドの品質検証におけるHPLCおよび質量分析法

HPLCは、ペプチド関連成分の分離やクロマトグラフィーによる純度の推定に一般的に用いられる一方、質量分析法は、質量電荷比データを評価することで分子の同定を裏付けるために用いられる。したがって、いずれの方法も、それ単体で完全な品質評価とみなすべきではない。むしろ、その結果は、ペプチド配列、塩形態、仕様、および試験方法と併せて解釈すべきである。.

HPLCおよび質量分析

HPLCからは何がわかるのか？

高速液体クロマトグラフィーは、試料成分を固定相および移動相との相互作用に基づいて分離する。したがって、この手法によって十分な分離が得られれば、対象ペプチドおよび関連する不純物は、別々のクロマトグラフィーピークとして現れることがある。.

USP一般編 <621> 定性および定量分析に使用されるクロマトグラフィー手法の一つとしてHPLCを取り上げているほか、システムの適合性に関する概念についても解説している。.

ただし、HPLCの面積比は、必ずしも以下のことを表すわけではありません：

  • 絶対ペプチド含有量；;
  • バイアルの充填精度；;
  • 不妊；;
  • エンドトキシン濃度；;
  • 分子同定；;
  • 残留水；;
  • 対イオン含有量。.
ペプチドの大量供給

質量分析では何がわかるのか？

質量分析法は、イオンの質量電荷比に基づいて測定を行うことで、分子に関する情報を提供します。したがって、観測された質量を、ペプチド配列や修飾情報から算出された予想質量と比較することができます。.

とはいえ、報告されている質量は、以下の要因の影響を受けている可能性がある：

  • 電荷状態；;
  • 付加体の生成；;
  • 対イオン；;
  • 同位体分布；;
  • 酸化または分解；;
  • 端末の修正；;
  • 共役標識；;
  • 楽器および処理の設定。.

HPLCとMSの比較

分析分野HPLC質量分析法
主な役割成分の分離と純度の推定分子量および同定の裏付け
典型的な出力例クロマトグラムおよびピーク面積データ質量スペクトルおよび観測イオンデータ
こんな時に便利純度、不純物プロファイル、および均一性予想される質量および構造の確認
主な制限事項それだけでは同一性を証明するものではないこれだけではクロマトグラフィー上の純度は確認できない
ベストプラクティス 結果は、仕様および方法と併せて解釈される

HPLCレポートではどのような点を確認すべきか？

レポート要素その重要性
試料の同定レポートをテスト済みのバッチに関連付けます
コラムと方法分析の背景を提供する
検出波長記録された信号の応答に影響を与える
保持時間ピーク比較に対応
ピーク面積比クロマトグラフィーによる純度算出に対応
統合ピークの境界がどのように割り当てられたかを示しています
システムの適合性分析中のメソッドの実行をサポートします
HPLCおよび質量分析法

分析法のバリデーション

分析方法は、その意図された目的に応じて設計・バリデーションされるべきである。したがって、バリデーション計画には、同定、定量、純度、不純物、またはその他の関連する特性など、測定対象となる具体的な品質属性が反映されていなければならない。.

ICH Q2(R2)では、特異性または選択性、正確性、精密度、報告可能範囲などの主要な性能特性が規定されています。さらに、システムの適合性試験は分析性能の定期的な確認を目的としており、一方、ロバストネスは通常、方法開発の段階で評価され、手順上のわずかな変動が結果に重大な影響を与えないことを確認します。.

よくある質問

HPLCおよび質量分析法

HPLCの結果が「98%」となっている場合、そのバイアルには重量比で98%ペプチドが含まれているということでしょうか？

必ずしもそうとは限りません。HPLCによる面積百分率と純ペプチド含有量は、異なる測定値です。.

MSは分子の同定を強力に裏付けることができますが、完全な配列の確認には、分子やプロジェクトによっては追加の手法が必要となる場合があります。.

カラム、グラジエント、波長、積分設定、装置、および試料の前処理が異なると、結果が異なる場合があります。.

はい。その報告書は、実際に試験が行われたロットまで遡及可能である必要があります。.

利用可能な分析データの提供依頼

選択した製品について、HPLCクロマトグラム、質量分析データ、試験方法、またはロットごとの分析記録が入手可能かどうかを確認してください。.

CTA