HPLC e espectrometria de massa para a verificação da qualidade dos péptidos
A HPLC é frequentemente utilizada para separar componentes relacionados com péptidos e estimar a pureza cromatográfica, enquanto a espectrometria de massa é utilizada para confirmar a identidade molecular através da avaliação dos dados de relação massa/carga. Por conseguinte, nenhum dos métodos deve ser considerado, por si só, como uma avaliação completa da qualidade. Em vez disso, os resultados devem ser interpretados tendo em conta a sequência do péptido, a forma salina, a especificação e o método de ensaio.
O que revela a HPLC?
A cromatografia líquida de alta eficiência separa os componentes da amostra de acordo com as suas interações com uma fase estacionária e uma fase móvel. Consequentemente, o péptido alvo e as impurezas associadas podem aparecer como picos cromatográficos distintos quando o método proporciona uma separação adequada.
Capítulo Geral da USP <621> inclui a HPLC entre as técnicas cromatográficas utilizadas para a análise qualitativa e quantitativa e aborda também os conceitos de adequação do sistema.
No entanto, a percentagem de área na HPLC não representa automaticamente:
- teor absoluto de péptidos;
- precisão no enchimento de frascos;
- esterilidade;
- nível de endotoxinas;
- identidade molecular;
- água residual;
- teor de contraiões.
O que revela a espectrometria de massa?
A espectrometria de massa fornece informação molecular através da medição de iões de acordo com as suas relações massa-carga. Por conseguinte, uma massa observada pode ser comparada com a massa esperada, calculada a partir da sequência do péptido e das suas modificações.
No entanto, a massa indicada pode ser influenciada por:
- estado de carga;
- formação de adutos;
- contraíons;
- distribuição isotópica;
- oxidação ou degradação;
- modificações nos terminais;
- marcadores conjugados;
- configurações do instrumento e de processamento.
Comparação entre HPLC e MS
| Área Analítica | HPLC | Espectrometria de massa |
|---|---|---|
| Função principal | Separação de componentes e estimativa da pureza | Dados relativos à massa molecular e à identificação |
| Resultado típico | Dados do cromatograma e da área dos picos | Espectro de massa e dados dos iões observados |
| Útil para | Pureza, perfil de impurezas e consistência | Confirmação da massa prevista e da estrutura |
| Principal limitação | Por si só, não prova a identidade | Por si só, não determina a pureza cromatográfica |
| Melhores práticas | Os resultados são interpretados em conjunto com a especificação e o método | |
O que deve ser analisado num relatório de HPLC?
| Elemento do relatório | Por que é importante |
|---|---|
| Identificação de amostras | Associa o relatório ao lote testado |
| Coluna e método | Fornece um contexto analítico |
| Comprimento de onda de deteção | Afeta a resposta do sinal gravado |
| Tempo de retenção | Suporta a comparação de picos |
| Percentagem da área do pico | Permite o cálculo da pureza cromatográfica |
| Integração | Mostra como foram atribuídos os limites dos picos |
| Adequação do sistema | Apoia o desempenho dos métodos durante a análise |
Validação de métodos analíticos
Um método analítico deve ser concebido e validado de acordo com a finalidade a que se destina. Por conseguinte, o plano de validação deve refletir o atributo de qualidade específico que está a ser medido, tal como identidade, dosagem, pureza, impurezas ou outra característica relevante.
A norma ICH Q2(R2) define as principais características de desempenho, incluindo especificidade ou seletividade, exatidão, precisão e intervalo de resultados reportáveis. Além disso, a adequação do sistema permite uma verificação de rotina do desempenho analítico, enquanto a robustez é normalmente avaliada durante o desenvolvimento do método, para confirmar que pequenas variações processuais não afetam significativamente os resultados.
Perguntas frequentes
Um resultado de HPLC para o 98% significa que o frasco contém o péptido 98% em peso?
Não necessariamente. A percentagem de área na HPLC e o teor líquido de péptidos são medidas diferentes.
A espectrometria de massa permite confirmar a sequência do péptido na íntegra?
A espectroscopia de ressonância magnética (RM) pode constituir um forte apoio à identificação molecular; no entanto, a confirmação completa da sequência poderá exigir métodos adicionais, dependendo da molécula e do projeto.
Por que razão os diferentes laboratórios apresentam valores de pureza por HPLC ligeiramente diferentes?
Colunas, gradientes, comprimentos de onda, parâmetros de integração, instrumentos e preparações de amostras diferentes podem produzir resultados diferentes.
Os cromatogramas devem estar associados a um número de lote?
Sim. O relatório deve poder ser associado ao lote que foi efetivamente testado.
Solicitar dados analíticos disponíveis
Verifique se existem cromatogramas de HPLC, dados de espectrometria de massa, métodos de ensaio ou registos analíticos específicos de cada lote disponíveis para o produto que selecionou.