ВЭЖХ и масс-спектрометрия для проверки качества пептидов

ВМХЛ широко используется для разделения компонентов, связанных с пептидами, и оценки хроматографической чистоты, тогда как масс-спектрометрия применяется для подтверждения молекулярной идентичности путем анализа данных о соотношении массы к заряду. Поэтому ни один из этих методов не следует рассматривать в отдельности как исчерпывающую оценку качества. Напротив, результаты следует интерпретировать с учетом аминокислотной последовательности пептида, формы соли, технических характеристик и метода испытаний.

ВЭЖХ и масс-спектрометрия

Что показывает ВЭЖХ?

Высокоэффективная жидкостная хроматография разделяет компоненты образца в зависимости от их взаимодействия со стационарной и подвижной фазами. Соответственно, целевой пептид и сопутствующие примеси могут проявляться в виде отдельных хроматографических пиков, если метод обеспечивает достаточное разделение.

Общая глава USP <621> включает ВЭЖХ в число хроматографических методов, используемых для качественного и количественного анализа, а также рассматривает концепции пригодности системы.

Однако процент площади, полученный при ВЭЖХ, не всегда означает:

  • абсолютное содержание пептидов;
  • точность розлива в ампулы;
  • бесплодие;
  • уровень эндотоксинов;
  • молекулярная идентичность;
  • остаточная вода;
  • содержание противоионов.
Поставки пептидов оптом

Что показывает масс-спектрометрия?

Масс-спектрометрия позволяет получить информацию о молекулах путем измерения ионов в зависимости от их отношения массы к заряду. Таким образом, наблюдаемую массу можно сравнить с расчетной массой, полученной на основе аминокислотной последовательности пептида и его модификаций.

Тем не менее на указанную массу могут влиять следующие факторы:

  • зарядовое состояние;
  • образование аддукта;
  • противоионы;
  • распределение изотопов;
  • окисление или разложение;
  • модификации терминалов;
  • конъюгированные метки;
  • настройки прибора и обработки.

Сравнение методов ВЭЖХ и МС

Аналитический отделВЭЖХМасс-спектрометрия
Основная рольРазделение компонентов и оценка степени очисткиДанные, подтверждающие молекулярную массу и идентичность
Типичный результатХроматограмма и данные о площади пиковДанные масс-спектра и наблюдаемых ионов
Полезно дляЧистота, профиль примесей и стабильностьОжидаемое подтверждение массы и структуры
Основное ограничениеСамо по себе это не доказывает тождествоСамо по себе не подтверждает хроматографическую чистоту
Передовой опыт Результаты интерпретируются с учетом технических требований и метода

Что следует отражать в отчете по ВЭЖХ?

Элемент отчетаПочему это важно
Идентификация образцаСвязывает отчет с проверенной партией
Колонка и методОбеспечивает аналитический контекст
Длина волны обнаруженияВлияет на характеристику записанного сигнала
Время удержанияПоддерживает сравнение пиковых значений
Процент площади пикаПоддерживает расчет хроматографической чистоты
ИнтеграцияПоказывает, как были определены границы пиков
Соответствие системы требованиямОбеспечивает эффективность метода в ходе анализа
ВЭЖХ и масс-спектрометрия

Валидация аналитических методов

Аналитический метод должен разрабатываться и валидироваться с учетом его предполагаемого назначения. Поэтому план валидации должен отражать конкретный измеряемый показатель качества, такой как идентичность, содержание, чистота, примеси или иная соответствующая характеристика.

В документе ICH Q2(R2) изложены ключевые характеристики эффективности, в том числе специфичность или селективность, точность, повторяемость и диапазон результатов, подлежащих отчетности. Кроме того, проверка пригодности системы обеспечивает регулярный контроль аналитической эффективности, тогда как устойчивость, как правило, оценивается на этапе разработки метода с целью подтверждения того, что незначительные отклонения в процедуре не оказывают существенного влияния на результаты.

Часто задаваемые вопросы

ВЭЖХ и масс-спектрометрия

Означает ли результат ВЭЖХ для 98%, что в ампуле содержится пептид 98% по массе?

Не обязательно. Процент площади пика по данным ВЭЖХ и чистое содержание пептида — это разные показатели.

МС может в значительной степени подтвердить идентичность молекулы; однако для полного подтверждения последовательности могут потребоваться дополнительные методы в зависимости от молекулы и проекта.

Различные колонки, градиенты, длины волн, параметры интегрирования, приборы и способы подготовки проб могут приводить к разным результатам.

Да. Отчет должен содержать информацию, позволяющую отследить партию, которая фактически прошла испытания.

Запрос доступных аналитических данных

Уточните, имеются ли для выбранного вами продукта хроматограммы ВЭЖХ, данные масс-спектрометрии, методики испытаний или аналитические протоколы по конкретной партии.

CTA