Guia de seleção da pureza dos péptidos
A escolha da pureza adequada do péptido deve partir da aplicação da investigação, e não da percentagem mais elevada disponível.
Por exemplo, um projeto de rastreio precoce pode não exigir as mesmas especificações que um ensaio de ligação quantitativa. Por outro lado, um péptido modificado, uma sonda fluorescente ou uma referência analítica podem exigir um controlo mais rigoroso das impurezas relacionadas com os péptidos.
Por conseguinte, isto guia de seleção da pureza dos péptidos ajuda os investigadores e os compradores a comparar os níveis de pureza mais comuns antes de solicitarem a produção de péptidos personalizados.
Na ALLGROWPEPTIDE, cada projeto deve ser avaliado de acordo com a complexidade da sequência, o método de investigação, a quantidade necessária, as modificações, os testes e o orçamento. Consequentemente, os clientes podem evitar custos de purificação desnecessários, sem deixar de selecionar uma especificação adequada.
Como selecionar a pureza dos péptidos
A pureza do péptido descreve a proporção do péptido alvo em relação às impurezas relacionadas com o péptido detetadas no âmbito de um método analítico definido.
No entanto, um único nível de pureza não é adequado para todas as experiências.
Em primeiro lugar, os investigadores devem ponderar se o péptido será adequado para triagem, trabalhos relacionados com anticorpos, análises bioquímicas, medições quantitativas ou investigação analítica de elevada sensibilidade.
Em seguida, devem avaliar se as impurezas intimamente relacionadas poderão interferir com o método pretendido.
Por fim, o grau de pureza selecionado deve ser confirmado juntamente com o pacote analítico e a quantidade de péptido necessária.
O guia de seleção publicado pela GenScript associa a pureza superior a 70% à produção ou teste de anticorpos, superior a 85% a ensaios enzimáticos e estudos de atividade biológica, superior a 95% à análise quantitativa e superior a 98% a determinados requisitos industriais. Estes valores constituem uma referência de mercado e não uma regra científica universal.
Pureza recomendada dos péptidos por aplicação de investigação
| Candidatura a um projeto de investigação | Pureza inicial recomendada | Considerações relativas à seleção |
|---|---|---|
| Triagem inicial de sequências | Petróleo bruto ≥70% | Indicado quando a comparação rápida de sequências é mais importante do que a precisão quantitativa |
| Investigação relacionada com antigénios ou anticorpos | ≥70%–80% | Analisar a conjugação, a sequência imunogénica e a sensibilidade do ensaio |
| Análises bioquímicas de rotina | ≥85%–90% | Reduz a interferência causada pelas principais impurezas relacionadas com os péptidos |
| Estudos de ligação ou quantitativos | ≥95% | Permite comparações mais consistentes de concentração e resposta |
| Investigação Analítica Sensível | ≥98% | Ter em conta o teor líquido de peptídeos e a realização de análises adicionais para detetar impurezas |
| Peptídeos modificados ou complexos | É necessária uma revisão técnica | As modificações e a complexidade da sequência podem limitar a pureza alcançável |
A tabela constitui um ponto de partida prático. No entanto, a especificação final deve seguir o protocolo de investigação efetivo e a viabilidade técnica.
O que mede a pureza dos péptidos por HPLC?
A HPLC de fase inversa separa o péptido alvo dos componentes detetáveis relacionados com o péptido.
Durante a análise, o sistema mede as áreas relativas dos picos cromatográficos. Por conseguinte, a percentagem indicada reflete normalmente o pico de referência em comparação com outros picos detetados nas condições selecionadas.
No entanto, a pureza determinada por HPLC não mede automaticamente:
- teor líquido de peptídeos;
- água residual;
- contraíons;
- sais inorgânicos;
- solventes residuais;
- quantidade de frascos;
- esterilidade;
- nível de endotoxinas.
Bachem explica que a pureza do péptido se refere, normalmente, ao péptido alvo em relação às impurezas que absorvem no comprimento de onda da ligação peptídica. Distingue também a pureza cromatográfica do teor líquido de péptido
Pureza, identidade e teor do péptido
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| Atributo de qualidade | O que avalia | Método típico |
|---|---|---|
| Pureza do peptídeo | Peptídeo-alvo em relação às impurezas relacionadas com o peptídeo detetado | RP-HPLC |
| Identidade molecular | Massa molecular observada em comparação com a estrutura esperada | Espectrometria de massa |
| Teor líquido de peptídeos | Porção real do péptido após ter em conta a água, os sais e os contraiões | AAA, análise elementar ou outro método validado |
| Quantidade | Quantidade fornecida no frasco ou recipiente | Método gravimétrico ou específico do projeto |
| Teor de contraiões | TFA associado, acetato ou outro contra-ião | Análise de iões ou ensaios específicos do projeto |
Fatores que afetam o grau de pureza exigido
1. Método de investigação
Os ensaios quantitativos exigem, normalmente, especificações mais rigorosas do que a triagem preliminar de sequências.
2. Complexidade da sequência
As sequências longas, hidrofóbicas, com tendência à agregação ou sensíveis à oxidação podem gerar impurezas muito semelhantes.
Tipo de modificação
Corantes fluorescentes, biotina, lípidos, ligantes, ciclização e resíduos não padrão podem alterar o comportamento da purificação.
Precisão da concentração
Quando os investigadores calculam a concentração com base apenas no peso total do frasco, a água e os contraiões podem afetar o resultado. Por conseguinte, o teor líquido de péptidos pode revelar-se importante.
Risco de interferência
Uma impureza em baixos níveis pode ter grande importância quando se liga ao mesmo alvo, absorve no mesmo comprimento de onda ou afeta a resposta do ensaio.
Documentos a solicitar antes de efetuar a encomenda
| Documento | Informações recomendadas |
|---|---|
| Certificado de Análise | Nome do produto, sequência, número de lote, especificações e resultados |
| Relatório de HPLC | Cromatograma, resumo do método, tempo de retenção e resultado da área do pico |
| Relatório de massa | Informações sobre a massa molecular, tanto teóricas como observadas |
| Declaração de Quantidade | Quantidade fornecida e base de cálculo |
| Testes adicionais | Dados relativos ao teor, à água, aos contraíons ou às endotoxinas, quando necessário |
Perguntas frequentes
Uma maior pureza do péptido é sempre melhor?
Uma maior pureza pode reduzir a interferência. No entanto, implica também um maior trabalho de purificação e pode aumentar os custos ou reduzir a quantidade recuperada. Por conseguinte, escolha a pureza de acordo com o método de investigação.
A pureza «95% HPLC» significa que o frasco contém o péptido 95% em peso?
Não necessariamente. A pureza determinada por HPLC e o teor líquido de peptídeos medem atributos diferentes.
A espectrometria de massa é o mesmo que os ensaios de pureza?
Não. A espectrometria de massa permite determinar a identidade molecular, enquanto a HPLC avalia normalmente a pureza cromatográfica.
Será que todos os péptidos podem atingir a pureza 98%?
Não. O comprimento da sequência, a agregação, a hidrofobicidade, as modificações e as impurezas intimamente relacionadas podem limitar o grau de pureza alcançável.
Que grau de pureza devo solicitar para a investigação quantitativa?
É comum uma especificação inicial de ≥95%. No entanto, o método analítico, os requisitos de teor e o risco de interferência também devem ser analisados.
Escolha um nível de pureza adequado à sua investigação
Envie a sua sequência, pedido de investigação, quantidade necessária, alterações e requisitos de ensaio.
A nossa equipa poderá então analisar o projeto e elaborar um orçamento com base nas especificações.