ВЕРХ та масова спектрометрія для перевірки якості пептидів

ВВХЛ зазвичай використовується для розділення компонентів, пов’язаних із пептидами, та оцінки хроматографічної чистоти, тоді як мас-спектрометрія застосовується для підтвердження молекулярної ідентичності шляхом аналізу даних про співвідношення маси до заряду. Отже, жоден із цих методів не слід розглядати як самостійну та вичерпну оцінку якості. Натомість результати слід інтерпретувати з урахуванням послідовності пептиду, форми солі, технічних характеристик та методу випробування.

ВЕРХ та мас-спектрометрія

Що показує ВЕРХ?

Високоефективна рідинна хроматографія розділяє компоненти зразка залежно від їхньої взаємодії зі стаціонарною та рухомою фазами. Отже, цільовий пептид та пов’язані з ним домішки можуть проявлятися у вигляді окремих хроматографічних піків, якщо метод забезпечує належне розділення.

Загальний розділ USP <621> включає ВЕЖХ до переліку хроматографічних методів, що застосовуються для якісного та кількісного аналізу, а також розглядає поняття придатності системи.

Однак відсоток площі піку за даними ВЕРХ не обов’язково означає:

  • абсолютний вміст пептидів;
  • точність наповнення флаконів;
  • стерильність;
  • рівень ендотоксинів;
  • молекулярна ідентичність;
  • залишкова вода;
  • вміст протиіонів.
Оптові поставки пептидів

Що показує масова спектрометрія?

Мас-спектрометрія дозволяє отримати інформацію про молекули шляхом вимірювання іонів за їхнім співвідношенням маса/заряд. Отже, виміряну масу можна порівняти з очікуваною масою, розрахованою на основі послідовності пептиду та його модифікацій.

Проте на зазначену масу можуть впливати такі фактори:

  • стан заряду;
  • утворення аддуктів;
  • протиіони;
  • розподіл ізотопів;
  • окислення або розпад;
  • модифікації терміналів;
  • кон'юговані мітки;
  • параметри приладу та обробки даних.

Порівняння методів ВЕРХ та МС

Аналітичний напрямВЕРХМасова спектрометрія
Основна рольРозділення компонентів та оцінка чистотиДані щодо молекулярної маси та ідентифікації
Типовий результатХроматограма та дані про площу піківМасовий спектр та дані про виявлені іони
Корисно дляЧистота, профіль домішок та стабільністьОчікуване підтвердження маси та структури
Основне обмеженняСамо по собі це не доводить тотожністьСама по собі не визначає хроматографічну чистоту
Передові практики Результати інтерпретуються з урахуванням технічних вимог та методу

Що слід перевіряти у звіті про ВЕРХ?

Елемент звітуЧому це важливо
Ідентифікація зразківВстановлює зв’язок між звітом і перевіреною партією
Розділ та методНадає аналітичний контекст
Довжина хвилі виявленняВпливає на характеристику записаного сигналу
Час утриманняПідтримує порівняння пікових значень
Відсоток площі пікуПідтримує розрахунок хроматографічної чистоти
ІнтеграціяПоказує, як були визначені межі піків
Придатність системиЗабезпечує ефективність методу під час аналізу
ВЕРХ та масова спектрометрія

Валідація аналітичних методів

Аналітичний метод слід розробляти та валідувати відповідно до його призначення. Тому план валідації повинен відображати конкретний показник якості, що підлягає вимірюванню, наприклад, ідентичність, вміст, чистоту, домішки або іншу відповідну характеристику.

У документі ICH Q2(R2) викладено основні характеристики ефективності, зокрема специфічність або селективність, точність, прецизійність та діапазон, що підлягає звітуванню. Крім того, перевірка придатності системи забезпечує регулярний контроль аналітичної ефективності, тоді як стійкість зазвичай оцінюється під час розробки методу, щоб підтвердити, що незначні відхилення у процедурі не впливають істотно на результати.

Поширені запитання

ВЕРХ та масова спектрометрія

Чи означає результат ВЕРХ для 98%, що флакон містить пептид 98% у ваговому відношенні?

Не обов’язково. Відсоток площі піку за даними ВЕРХ та чистий вміст пептиду — це різні величини.

МС може бути надійним методом підтвердження молекулярної ідентичності; однак для повного підтвердження послідовності можуть знадобитися додаткові методи, залежно від молекули та проекту.

Різні колонки, градієнти, довжини хвиль, параметри інтегрування, прилади та способи підготовки зразків можуть давати різні результати.

Так. Звіт повинен містити інформацію, що дозволяє відстежити партію, яка фактично пройшла випробування.

Запит на доступні аналітичні дані

Дізнайтеся, чи є для обраного вами продукту хроматограми ВЕРХ, дані масс-спектрометрії, методи випробувань або аналітичні записи щодо конкретної партії.

CTA