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HPLC y espectrometría de masas para la verificación de la calidad de los péptidos
La HPLC se utiliza habitualmente para separar componentes relacionados con los péptidos y estimar la pureza cromatográfica, mientras que la espectrometría de masas se emplea para confirmar la identidad molecular mediante el análisis de los datos de relación masa-carga. Por lo tanto, ninguno de estos métodos debe considerarse por sí solo como una evaluación completa de la calidad. Por el contrario, los resultados deben interpretarse teniendo en cuenta la secuencia del péptido, la forma salina, las especificaciones y el método de ensayo.
¿Qué muestra la HPLC?
La cromatografía líquida de alta resolución separa los componentes de la muestra en función de sus interacciones con una fase estacionaria y una fase móvil. Por consiguiente, el péptido objetivo y las impurezas asociadas pueden aparecer como picos cromatográficos separados cuando el método proporciona una separación adecuada.
Capítulo general de la USP <621> incluye la HPLC entre las técnicas cromatográficas utilizadas para el análisis cualitativo y cuantitativo, y también aborda los conceptos relacionados con la idoneidad del sistema.
Sin embargo, el porcentaje de área en HPLC no representa automáticamente:
- contenido absoluto de péptidos;
- precisión en el llenado de viales;
- esterilidad;
- nivel de endotoxinas;
- identidad molecular;
- agua residual;
- contenido de contraiones.
¿Qué revela la espectrometría de masas?
La espectrometría de masas proporciona información molecular mediante la medición de los iones en función de su relación masa-carga. Por lo tanto, la masa observada puede compararse con la masa esperada, calculada a partir de la secuencia del péptido y sus modificaciones.
No obstante, la masa indicada puede verse afectada por:
- estado de carga;
- formación de aductos;
- contraiones;
- distribución isotópica;
- oxidación o degradación;
- modificaciones en los terminales;
- marcadores conjugados;
- ajustes del instrumento y de procesamiento.
Comparación entre HPLC y MS
| Área analítica | HPLC | Espectrometría de masas |
|---|---|---|
| Función principal | Separación de componentes y estimación de la pureza | Datos sobre la masa molecular y la identificación |
| Resultado típico | Datos del cromatograma y del área de los picos | Espectro de masas y datos de iones observados |
| Útil para | Pureza, perfil de impurezas y consistencia | Confirmación de la masa prevista y de la estructura |
| Limitación principal | Por sí solo, no demuestra la identidad | Por sí sola, no determina la pureza cromatográfica |
| Buenas prácticas | Los resultados se interpretan teniendo en cuenta las especificaciones y el método. | |
¿Qué aspectos deben analizarse en un informe de HPLC?
| Elemento del informe | Por qué es importante |
|---|---|
| Identificación de muestras | Vincula el informe al lote sometido a ensayo |
| Columna y método | Aporta un contexto analítico |
| Longitud de onda de detección | Afecta a la respuesta de la señal grabada |
| Tiempo de retención | Permite comparar picos |
| Porcentaje del área del pico | Permite calcular la pureza cromatográfica |
| Integración | Muestra cómo se asignaron los límites de los picos |
| Idoneidad del sistema | Facilita la ejecución de los métodos durante el análisis |
Validación de métodos analíticos
Un método analítico debe diseñarse y validarse en función de la finalidad prevista. Por lo tanto, el plan de validación debe reflejar el atributo de calidad específico que se va a medir, como la identidad, el contenido, la pureza, las impurezas u otra característica relevante.
La norma ICH Q2(R2) describe las características clave del rendimiento, entre las que se incluyen la especificidad o selectividad, la exactitud, la precisión y el rango de resultados notificables. Además, la idoneidad del sistema permite realizar un control rutinario del rendimiento analítico, mientras que la robustez suele evaluarse durante el desarrollo del método para confirmar que las pequeñas variaciones en el procedimiento no afectan de manera significativa a los resultados.
Preguntas frecuentes
¿Significa un resultado de HPLC de 98% que el vial contiene el péptido 98% en peso?
No necesariamente. El porcentaje de área en HPLC y el contenido neto de péptidos son magnitudes diferentes.
¿Puede la espectrometría de masas confirmar la secuencia del péptido por completo?
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) puede servir de gran ayuda para determinar la identidad molecular; sin embargo, la confirmación completa de la secuencia puede requerir métodos adicionales, dependiendo de la molécula y del proyecto.
¿Por qué los distintos laboratorios indican valores de pureza por HPLC ligeramente diferentes?
Las diferentes columnas, gradientes, longitudes de onda, parámetros de integración, instrumentos y preparaciones de las muestras pueden dar lugar a resultados distintos.
¿Deben vincularse los cromatogramas a un número de lote?
Sí. El informe debe poder relacionarse con el lote que se sometió realmente a ensayo.
Solicitar los datos analíticos disponibles
Pregunta si hay disponibles cromatogramas de HPLC, datos de espectrometría de masas, métodos de ensayo o registros analíticos específicos de cada lote para el producto que has seleccionado.