Пептид в твердой фазе Синтез по-прежнему остается основным способом получения многих пептидов, разрабатываемых по индивидуальному заказу. Однако эта область уже не ограничивается одной моделью производства. Синтез пептидов в жидкой фазе (LPPS), методы с использованием растворимых меток, гибридные процессы, поточная химия, ферментативные этапы и лигирование фрагментов в настоящее время расширяют спектр доступных последовательностей и масштабов производства.
Выбор метода имеет большое значение, поскольку синтез пептидов сопряжён с целым рядом химических сложностей. При каждой стадии соединения необходимо обеспечить образование правильной амидной связи, одновременно сводя к минимуму рацемизацию, делецию, перегруппировку, окисление и реакции боковых цепей. По мере удлинения цепи могут также изменяться растворимость и склонность к агрегации.
Модификации пептидов добавляют ещё один уровень сложности. Исследователь может заказать фосфорилирование для изучения сигнальных путей, биотин — для аффинного захвата, флуоресцентный краситель — для визуализации, жирную кислоту — для исследования взаимодействия с мембранами или циклизацию — для фиксации конформации. Каждый из этих вариантов влияет на молекулярную массу, заряд, гидрофобность, особенности очистки и, зачастую, на условия хранения.
В недавних обзорах синтез пептидов описывается как совокупность взаимодополняющих технологий, а не как соревнование, в котором есть один-единственный победитель. К ним относятся классический растворный синтез, SPPS, LPPS, лигация, проточные методы, фотокаталитические подходы, электрохимия и гибридные стратегии производства.
В этой статье рассказывается, чем LPPS отличается от SPPS, как химики разрабатывают модифицированные пептиды, как лаборатории оценивают сложные последовательности и какие аналитические контрольные пробы обеспечивают надежность исследовательских материалов.
При синтезе пептидов в жидкой фазе промежуточные соединения пептидов образуются в условиях, когда они остаются растворимыми или диспергируемыми в жидкой реакционной среде.
При классическом синтезе в растворе промежуточное соединение часто выделяют и очищают после одного или нескольких этапов соединения. В современном LPPS вместо этого могут использоваться растворимая молекулярная метка, группа, обеспечивающая переход фазы, стратегия осаждения, мембранное разделение, экстракция или другой метод, упрощающий извлечение промежуточного соединения.
Метод LPPS с использованием меток направлен на объединение полезных свойств химии растворов и синтеза с использованием носителя. Гидрофобная или иным образом модифицированная метка может изменять растворимость формирующейся цепи, что позволяет отделять реагенты и побочные продукты путем экстракции или осаждения.
Например, в методе AJIPHASE используется подход с использованием «якорей» и многократное удлинение цепи в растворной фазе. В одной из опубликованных работ была описана стратегия «в одной емкости», при которой промежуточные соединения выделялись с помощью экстракции растворителем вместо традиционной хроматографической очистки после каждого этапа.
LPPS — это метод химического синтеза. Это не пептид, и у него нет молекулярной формулы или молекулярной массы.
Продукцией компании LPPS являются пептиды с заданной аминокислотной последовательностью, пептидные фрагменты или защищенные пептидные промежуточные соединения. Их молекулярные свойства зависят от аминокислотной последовательности, химического состава концевых групп, защитных групп, меток и конечных модификаций.
Важное научное различие: Синтез пептидов в жидкой фазе не следует путать с фазовым разделением «жидкость–жидкость», растворением пептидов, приготовлением водных растворов или биологическим рибосомным синтезом. Термин LPPS относится именно к химическому построению пептидной цепи с использованием растворимых промежуточных соединений или соединений, фазовое поведение которых можно регулировать.
Основным компонентом по-прежнему является цепь аминокислот, соединенных пептидными связями:
–NH–CHR–CO–NH–CHR–CO–
Однако в процессе синтеза реактивные группы требуют контролируемого защищения.
Fmoc защищает альфа-аминогруппу во время соединения и впоследствии может быть удалена в щелочных условиях. Boc представляет собой альтернативную стратегию, основанную на кислотной лабильности.
Реактивные боковые цепи также нуждаются в защите. Примеры:
Схема защитных групп должна оставаться ортогональной. Иными словами, одна реакция должна удалять целевую группу, не разрушая при этом остальные.
Метод LPPS с использованием тегов предусматривает присоединение синтезируемого пептида к растворимому вспомогательному веществу. Это вещество может повысить растворимость в органической фазе или облегчить селективное выделение. После сборки цепи химик удаляет тег, чтобы высвободить целевой пептид.
Постоянные модификации пептидов отличаются от временных защитных групп тем, что модификация сохраняется в конечном продукте. В техническом обзоре компании Bachem также проводится различие между постоянными химическими изменениями и группами, используемыми исключительно для управления процессом синтеза.
В методе SPPS растущую цепь присоединяют к нерастворимой смоле. Химики добавляют реагенты в избытке, а затем удаляют растворимый материал путем фильтрации и промывки.
К преимуществам относятся:
К числу проблем относятся:
В рамках отраслевого анализа 40 технологических процессов по производству пептидов, проведенного в 2024 году, было отмечено, что средний показатель массовой интенсивности процесса для SPPS составляет примерно 13 000, что свидетельствует о значительном объеме использования материалов при современном производстве пептидов.
В методе LPPS промежуточные соединения содержатся в растворе или используется растворимый носитель.
К потенциальным преимуществам относятся:
К числу потенциальных проблем относятся:
Многие современные методы сочетают в себе особенности обеих платформ. В рамках одного проекта могут использоваться SPPS для подготовки фрагментов, LPPS для отдельных этапов удлинения, а также нативная химическая лигация для соединения очищенных сегментов.
Поэтому выбор метода должен зависеть от последовательности и предполагаемого масштаба, а не от универсального утверждения о том, что одна платформа всегда работает лучше.
Протеинкиназы присоединяют фосфатные группы к остаткам серина, треонина или тирозина в биологических системах. Синтетические фосфопептиды позволяют исследователям изучать распознавание киназами, активность фосфатаз, специфичность антител, связывание с сигнальными доменами, а также взаимодействия, зависящие от модификаций.
Фосфорилирование приводит к появлению отрицательного заряда и может влиять на удерживаемость при обращенно-фазовой ВЭЖХ. Многократно фосфорилированные последовательности могут создавать сложности при синтезе и хроматографическом разделении из-за повышенной кислотности и изменений в поведении при активации или очистке.
N-концевое ацетилирование нейтрализует концевую аминогруппу, тогда как C-концевое амидирование удаляет отрицательный заряд, связанный со свободной концевой карбоксильной группой.
Эти модификации могут более точно воспроизводить нативную последовательность, повысить устойчивость к некоторым экзопептидазам или изменить взаимодействие с рецептором. Однако их не следует добавлять автоматически, поскольку заряд на концевой группе может быть частью предполагаемого экспериментального механизма.
Биотин может использоваться в методах иммобилизации, аффинного захвата, пулл-даун-анализа, а также для детектирования с помощью систем на основе авидина или стрептавидина.
Приложение Важны как местоположение, так и длина линкера. Прямое N-концевое биотинилирование может блокировать мотив распознавания, а чрезмерно длинный или гидрофобный линкер может изменить поведение. Соответствующий немеченый пептид помогает выявить эффекты, связанные с мечением.
Флуорофоры позволяют проводить микроскопические исследования, определять локализацию, измерять поглощение, связывание и расщепление ферментами.
Тем не менее флуорофор может составлять значительную долю конечной молекулярной массы и площади гидрофобной поверхности. Он также может влиять на заряд, агрегацию, неспецифическое связывание с мембраной и удержание при ВЭЖХ.
Жирные кислоты или другие группы липидов могут усиливать связывание с мембраной, гидрофобность, взаимодействие с альбумином или самоорганизацию.
Липидизированные пептиды могут потребовать применения модифицированных методов очистки и повышения растворимости. Образование мицелл может влиять на кажущуюся концентрацию и биологические показатели.
В результате циклизации могут соединяться N- и C-концы, две боковые цепи или боковая цепь и конец. Связи могут представлять собой амидные, дисульфидные, тиоэфирные, эфирные, углерод-углеродные связи или связи, образованные в результате реакции «клик».
Циклические структуры могут снижать конформационную гибкость и иногда повышать устойчивость к ферментативному распаду. Тем не менее циклизация не гарантирует наличие одной активной конформации, более высокого сродства или упрощения синтеза. Важную роль играют размер кольца, аминокислотная последовательность, концентрация реагентов и конкурирующая олигомеризация.
Тяжёлые изотопы углерода, азота, водорода или кислорода могут служить внутренними стандартами для количественной масс-спектрометрии.
Положения меченых остатков должны обеспечивать достоверность аналитического метода и исключать потерю или обмен изотопов. Лаборатории также должны проводить различие между изотопным обогащением, химической чистотой и содержанием пептидов.
Модифицированные пептиды позволяют исследователям выделить одну молекулярную переменную.
Например, в рамках исследования можно сравнить:
Такая парная схема может способствовать более глубокому пониманию механизмов. Тем не менее, по возможности следует изменять только одну переменную. Если изменяются и последовательность, и метка, результат может не позволить определить, какое именно изменение вызвало данный эффект.
В методе SPPS пептид синтезируется по одному защищенному остатку за раз. Этот метод по-прежнему остается особенно полезным для производства в исследовательских масштабах, синтеза модифицированных пептидов и параллельного синтеза.
При синтезе в растворе пептидные фрагменты или короткие пептиды получают и выделяют с помощью методов традиционной органической химии. Этот метод может быть подходящим для коротких последовательностей, конвергентной сборки фрагментов или крупномасштабных процессов, в которых хорошо работают методы кристаллизации или экстракции.
Растворимый маркер регулирует фазовое поведение и позволяет проводить многократное соединение, депротекцию и выделение. Данный подход направлен на снижение трудоемкости очистки, традиционно связанной с синтезом в растворе.
NCL соединяет пептидный тиоэфир с пептидом, содержащим N-концевой цистеин, в результате чего в конечном итоге образуется нативная амидная связь.
Эта технология позволяет синтезировать более длинные полипептиды и белки с сайт-специфическими модификациями из синтетических фрагментов. Расширения, включающие десульфуризацию и альтернативные тиолсодержащие остатки, позволили увеличить количество возможных сайтов лигации.
Ферменты могут образовывать или модифицировать пептидные связи в определённых условиях. Хемоферментативные технологические процессы сочетают в себе химический контроль и ферментативную селективность, хотя на их осуществимость влияют спектр субстратов, доступность ферментов и разработка технологического процесса.
Рассмотрим гипотетический пептид, состоящий из 42 остатков, с:
При использовании прямого метода синтеза SPPS из одного фрагмента могут возникнуть такие проблемы, как агрегация, неполное соединение, окисление и сложности с очисткой.
В рамках структурированного анализа осуществимости можно сравнить три варианта:
Преимущества:
Риски:
Преимущества:
Риски:
Преимущества:
Риски:
Выбор оптимального подхода зависит от масштаба эксперимента, имеющегося оборудования, совместимости компонентов и приемлемых сроков разработки. Поставщик не должен обещать успех, основываясь исключительно на количестве остаточных веществ.
В приведенной ниже таблице представлены общие характеристики, описанные в современных обзорных работах по синтезу пептидов.
| Параметр | SPPS | LPPS | Сшивание фрагментов |
|---|---|---|---|
| Промежуточное состояние | Прикреплён к нерастворимой смоле | Растворимые или с использованием маркеров | Очищенные пептидные фрагменты |
| Основная операция | Соединение, промывка и фильтрация | Сопряжение с экстракцией или осаждением | Хемоселективное соединение фрагментов |
| Автоматизация | Имеющий прочную репутацию | Зависимое от процесса | Менее стандартизированный |
| Промежуточный анализ | Требуется отбор проб смолы или расщепление | Часто проще найти решение | Каждый фрагмент можно проанализировать |
| Избыток реагента | Часто относительно высокий | В оптимизированных системах этот показатель может быть снижен | Зависит от химии лигирования |
| Общая сила | Исследование пептидов и их модификаций | Процессы масштабирования и с использованием растворимых меток | Более длинные полипептиды и белки |
| Основная задача | Использование растворителей и агрегация на смоле | Промежуточная изоляция и растворимость | Проектирование соединений и обработка фрагментов |
| Основное отличие | Нерастворимый носитель | Сборка цепи в жидкой фазе | Соединяет предварительно сформированные пептидные сегменты |
Модификация влияет на стабильность и управляемость. Поэтому в лаборатории следует избегать копирования инструкций по хранению из несвязанной последовательности.
Цистеин, метионин и триптофан могут подвергаться окислению. На этот процесс могут влиять воздействие кислорода, свет, загрязнение металлами и условия раствора.
Фосфопептиды могут демонстрировать растворимость и хроматографические характеристики, отличающиеся от характеристик их немодифицированных аналогов. Применение сильнокислых условий или длительная обработка также могут потребовать оценки с учетом специфики конкретного проекта.
Защищайте флуоресцентные метки от излишнего освещения. Кроме того, проверьте, не изменяет ли краситель кажущуюся растворимость или не способствует ли он адсорбции на пластиковых поверхностях.
Гидрофобные конъюгаты могут образовывать агрегаты или мицеллы. Указанная концентрация в растворе может не совпадать с концентрацией свободно диспергированного мономера.
Для образования дисульфидных связей необходимо контролировать процессы окисления и образования пар. Пептид, содержащий четыре аминокислоты цистеина, теоретически может образовывать различные схемы спаривания, поэтому по одной только массе невозможно различить все изомеры дисульфидных связей.
Лиофилизация зачастую повышает стабильность при хранении за счет снижения подвижности молекул и интенсивности гидролитических реакций. Тем не менее на стабильность по-прежнему влияют остаточная влага, состав препарата, температура и структура пептида в твёрдом состоянии.
Проверьте последовательность, группы на концах цепи, положение модификации, противоион, степень окисления и место мечения.
Не следует полагаться на сокращённое название продукта.
Сравните расчетную и измеренную массу, хроматографическую чистоту, данные о модификации и любые результаты анализа содержания.
Не следует полагать, что наличие одного выраженного пика при ВЭЖХ однозначно свидетельствует о правильной модификации.
Перед открытием дайте контейнеру нагреться до комнатной температуры.
Не допускайте образования конденсата на холодных материалах.
Учтите заряд, гидрофобность, химические свойства красителей, содержание липидов и совместимость с методами анализа.
Не следует насильно растворять в воде каждый модифицированный пептид.
Начните с контролируемого объема, осмотрите образец и постепенно разбавляйте.
Следует избегать чрезмерного вихревого перемешивания материалов, склонных к агрегации или легко подвергающихся окислению.
Подготовьте объемы, соответствующие условиям эксперимента.
Не допускайте многократного замораживания и размораживания всего запаса.
По мере необходимости ограничивайте воздействие избыточного света, кислорода, тепла или экстремальных значений pH.
Не следует хранить пробирки без этикеток, на которых не указаны сведения о модификации.
МС или ЛХ-МС должны подтвердить, что наблюдаемая масса соответствует структуре целевого соединения. В случае крупных флуорофоров, липидных групп или изотопных меток в расчёт необходимо включить полный конъюгат.
Метод RP-HPLC позволяет оценить долю основного обнаруженного компонента при использовании заданной методики. В случае совместной элюции примесей могут помочь ортогональные градиенты или стационарные фазы.
Точная общая масса не всегда позволяет определить место модификации. Может потребоваться применение тандемной масс-спектрометрии, ферментативного расщепления, ЯМР, анализа аминокислот или других методов определения структуры.
Пептид может иметь ожидаемую общую массу, но неправильное расположение дисульфидных связей. Для определения структуры может потребоваться селективное восстановление, ферментативное расщепление, LC-MS/MS или сравнение с проверенными эталонами.
Лиофилизированный материал может содержать пептид, противоионы, воду, остатки растворителя и компоненты буфера. Поэтому взвешивание порошка не всегда позволяет определить молярное количество пептида.
При сравнении партий следует использовать единые аналитические методы. Смена колонки ВЭЖХ, градиента, длины волны детектирования, правила интегрирования или концентрации образца может привести к тому, что две в остальном схожие партии будут выглядеть разными.
LPPS — это химический метод, при котором происходит сборка пептидных цепей, при этом растущий промежуточный продукт остается растворимым или контролируется с помощью растворимого маркера либо вспомогательного вещества, фазовое поведение которого можно регулировать. В современных системах для удаления избыточных реагентов и побочных продуктов между циклами могут применяться методы экстракции, осаждения или мембранной изоляции.
Нет. LPPS — это платформа для синтеза. Продуктом является пептид, фрагмент пептида или защищенное промежуточное соединение. Как технологический процесс, LPPS не имеет единой формулы, молекулярной массы, биологической активности или температуры хранения.
Метод SPPS фиксирует формирующуюся пептидную цепь на нерастворимой смоле и удаляет растворимые вещества путем промывки. Метод LPPS позволяет удерживать формирующуюся цепь в жидкофазной системе и основан на экстракции, осаждении, хроматографии, мембранном разделении или фазовом поведении с использованием меток. Каждый из этих методов обладает своими преимуществами с точки зрения автоматизации, анализа, использования реагентов, масштабируемости и работы с сложными последовательностями.
Нет. Эффективность зависит от последовательности, масштаба, химического состава меток, метода выделения, системы растворителей, модификации и конечной требуемой степени чистоты. Для многих исследовательских пептидов метод SPPS может оставаться более быстрым и простым, тогда как метод LPPS может дать преимущества в определенных случаях, связанных с увеличением масштаба или мониторингом раствора.
Модификации пептидов — это необратимые структурные изменения, присутствующие в конечном продукте. К ним относятся, например, фосфорилирование, ацетилирование, амидирование, метилирование, биотинилирование, флуоресцентная маркировка, липидирование, гликозилирование, циклизация и введение стабильных изотопов. Они отличаются от временных защитных групп, которые удаляются в процессе синтеза.
Часто да, но реализуемость снижается по мере увеличения сложности структуры. Каждая добавленная группа может повлиять на степень связывания, депротекцию, растворимость, очистку, аналитическое обнаружение и стабильность. Проект, предусматривающий многокомпонентную модификацию, должен пройти техническую экспертизу до утверждения окончательной спецификации.
Модификация может привести к образованию близкородственных побочных продуктов, изменению гидрофобности, повышению кислотности, агрегации или образованию позиционных и окислительных изомеров. Последовательности, удаленные в результате делеции, также могут иметь время удержания, близкое к целевому. Подходящий метод очистки должен обеспечивать выделение именно целевой структуры, а не просто давать один доминирующий пик.
Масс-спектрометрия позволяет подтвердить изменение массы, характерное для фосфорилирования. Однако в тех случаях, когда фосфатная группа может быть присоединена к нескольким аминокислотным остаткам, одной лишь массы интактного молекулы может оказаться недостаточно для определения точного местоположения. В таких случаях может потребоваться тандемная масс-спектрометрия, анализ фрагментов, ферментативные исследования или другой метод, позволяющий определить конкретное место фосфорилирования.
Нет. Циклизация может ограничивать конформацию и снижать чувствительность к некоторым протеазам, однако этот эффект зависит от размера кольца, характера химической связи, аминокислотной последовательности и условий проведения анализа. Неправильно сформированные дисульфидные связи или неправильно спроектированные кольца могут снижать активность или приводить к образованию гетерогенных продуктов.
Условия хранения должны обеспечивать стабильность как пептида, так и флуорофора. В целом лабораториям следует минимизировать ненужное воздействие света, ограничивать количество циклов замораживания-размораживания, использовать совместимые контейнеры и контролировать агрегацию или адсорбцию. Точная температура и растворитель зависят от аминокислотной последовательности и типа красителя.
Базовый пакет обычно включает аналитическую ВЭЖХ и МС или ЖХ-МС. Для более сложных проектов могут потребоваться тандемная масс-спектрометрия, анализ аминокислот, ЯМР, картирование дисульфидных связей, оптическая спектроскопия, анализ содержания пептидов, анализ воды, определение остаточного растворителя или функциональный анализ.
Лигирование фрагментов становится целесообразным в тех случаях, когда прямой поэтапный синтез приводит к низкому качеству сырого продукта, сильной агрегации или затрудняет очистку, особенно в случае длинных или сильно модифицированных целевых молекул. Последовательность должна обеспечивать возможность применения подходящей стратегии лигирования, а каждый фрагмент должен оставаться доступным в достаточном количестве и с надлежащей степенью чистоты.
SPPS, синтез пептидов в жидкой фазе (LPPS) и лигирование фрагментов представляют собой взаимодополняющие стратегии. SPPS отличается отработанной автоматизацией и широкой гибкостью в исследовательских масштабах. LPPS обеспечивает возможность мониторинга в растворной фазе и потенциальные преимущества в плане масштабирования или использования реагентов в подходящих процессах. Лигирование фрагментов расширяет химические возможности синтеза более длинных и сложных полипептидов.
Модификации пептидов позволяют разрабатывать высокоспецифичные исследовательские схемы, однако они также влияют на молекулярную массу, заряд, растворимость, условия очистки, стабильность и аналитические требования. Поэтому исследователям следует четко определять цель каждой модификации и, по возможности, включать соответствующие контрольные группы.
Полная оценка качества должна включать в себя проверку идентичности, чистоты, содержания, подтверждение мест модификации, а также соответствие последовательности при работе с веществом. Ни одна отдельная хроматограмма ВЭЖХ или масс-спектральный сигнал не могут дать ответ на все вопросы, касающиеся качества.
Только для научных целей. Не предназначено для применения у людей.
