HPLC et spectrométrie de masse pour la vérification de la qualité des peptides
La HPLC est couramment utilisée pour séparer les composants liés aux peptides et estimer la pureté chromatographique, tandis que la spectrométrie de masse sert à confirmer l'identité moléculaire en analysant les données de rapport masse/charge. Par conséquent, aucune de ces deux méthodes ne doit être considérée à elle seule comme une évaluation complète de la qualité. Les résultats doivent plutôt être interprétés en tenant compte de la séquence peptidique, de la forme saline, des spécifications et de la méthode d'analyse.
Que révèle la HPLC ?
La chromatographie liquide à haute performance sépare les composants d'un échantillon en fonction de leurs interactions avec une phase stationnaire et une phase mobile. Par conséquent, le peptide cible et les impuretés associées peuvent apparaître sous forme de pics chromatographiques distincts lorsque la méthode permet une séparation adéquate.
Chapitre général de l'USP <621> cite la HPLC parmi les techniques chromatographiques utilisées pour l'analyse qualitative et quantitative, et aborde également les concepts liés à l'adéquation du système.
Cependant, un pourcentage de surface HPLC ne correspond pas automatiquement à :
- teneur absolue en peptides ;
- précision de remplissage des flacons ;
- stérilité ;
- taux d'endotoxines ;
- identité moléculaire ;
- eau résiduelle ;
- teneur en contre-ions.
Que révèle la spectrométrie de masse ?
La spectrométrie de masse fournit des informations moléculaires en mesurant les ions en fonction de leur rapport masse/charge. Ainsi, une masse observée peut être comparée à la masse attendue, calculée à partir de la séquence peptidique et des modifications.
Toutefois, la masse indiquée peut être influencée par :
- état de charge ;
- formation d'adduits ;
- contre-ions ;
- répartition isotopique ;
- oxydation ou dégradation ;
- modifications des terminaux ;
- marqueurs conjugués ;
- paramètres de l'instrument et de traitement.
Comparaison entre la HPLC et la MS
| Domaine d'analyse | HPLC | Spectrométrie de masse |
|---|---|---|
| Fonction principale | Séparation des composants et estimation de la pureté | Données relatives à la masse moléculaire et à l'identité |
| Exemple de résultat | Chromatogramme et données relatives à la surface des pics | Spectre de masse et données sur les ions observés |
| Utile pour | Pureté, profil d'impuretés et homogénéité | Confirmation de la masse prévue et de la structure |
| Principale limite | Cela ne prouve pas à lui seul l'identité | Ne permet pas à lui seul d'établir la pureté chromatographique |
| Bonnes pratiques | Les résultats sont interprétés à la lumière de la spécification et de la méthode | |
Quels éléments faut-il examiner dans un rapport HPLC ?
| Élément de rapport | Pourquoi est-ce important ? |
|---|---|
| Identification des échantillons | Associe le rapport au lot testé |
| Colonne et méthode | Fournit un contexte analytique |
| Longueur d'onde de détection | Influence la réponse du signal enregistré |
| Temps de rétention | Prend en charge la comparaison des pics |
| Pourcentage de la surface du pic | Permet de calculer la pureté chromatographique |
| Intégration | Illustre la manière dont les limites des pics ont été définies |
| Adéquation du système | Contribue à l'efficacité de la méthode lors de l'analyse |
Validation des méthodes d'analyse
Une méthode d'analyse doit être conçue et validée en fonction de l'usage auquel elle est destinée. Par conséquent, le plan de validation doit tenir compte de l'attribut de qualité spécifique à évaluer, tel que l'identité, la teneur, la pureté, les impuretés ou toute autre caractéristique pertinente.
La norme ICH Q2(R2) définit les principales caractéristiques de performance, notamment la spécificité ou la sélectivité, l'exactitude, la précision et la plage de mesure. Par ailleurs, l'adéquation du système permet de vérifier régulièrement les performances analytiques, tandis que la robustesse est généralement évaluée lors du développement de la méthode afin de s'assurer que de légères variations procédurales n'affectent pas de manière significative les résultats.
Foire aux questions
Un résultat HPLC de 98% signifie-t-il que le flacon contient du peptide 98% en poids ?
Pas nécessairement. Le pourcentage de surface par HPLC et la teneur nette en peptides sont deux mesures différentes.
La spectrométrie de masse permet-elle de confirmer la séquence peptidique de manière définitive ?
La spectrométrie de masse peut constituer un excellent outil de validation de l'identité moléculaire ; toutefois, la confirmation complète de la séquence peut nécessiter le recours à des méthodes supplémentaires, en fonction de la molécule et du projet.
Pourquoi différents laboratoires indiquent-ils des taux de pureté obtenus par HPLC légèrement différents ?
Les résultats peuvent varier en fonction des colonnes, des gradients, des longueurs d'onde, des paramètres d'intégration, des instruments et des méthodes de préparation des échantillons utilisés.
Faut-il associer les chromatogrammes à un numéro de lot ?
Oui. Le rapport doit permettre de remonter jusqu'au lot qui a effectivement été testé.
Demande de données analytiques disponibles
Demandez si des chromatogrammes HPLC, des données de spectrométrie de masse, des méthodes d'essai ou des rapports d'analyse spécifiques à chaque lot sont disponibles pour le produit que vous avez sélectionné.